一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4的制作方法

文档序号:12248545阅读:335来源:国知局

背景技术
:中国酿酒历史悠久,酒文化底蕴深厚。在漫长的酿酒实践中,形成了各具特色、风格迥异的多种香型的白酒;其中,芝麻香型白酒既有清香型白酒的清净典雅,又具有浓香型白酒的绵柔丰满,还具有酱香型白酒的幽雅细腻,综合感官有焙烤芝麻的特殊香味等特点,形成了独特的口感和风格特征。芽孢杆菌是生产芝麻香型白酒的有益菌株,细菌纯种制曲的使用,对芝麻香型麸曲酒的生产具有重要意义。芝麻香型白酒注重“高温堆积、高温发酵”的工艺原则,产蛋白酶嗜热细菌制备的麸曲、强化大曲等,具有一定的液化力、糖化力及蛋白质水解力等,有利于原料中淀粉的糖化和蛋白质的分解,为生成芝麻香白酒所需的含氮化合物提供了保证,强化了美拉德反应,生成多种酮、醛、醇及呋喃等一系列风味物质,在芝麻香型白酒风味物质的生成过程中起到重要作用,有助于提高原酒的品质和出酒率。技术实现要素:本发明提供一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株Nxzd4,该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC),保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号;菌种保藏号:CGMCCNO.12439,保藏日期:2016.05.12。本发明一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439)菌株的最佳培养基组成是:(1)、固体斜面培养基:干酪素5g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、琼脂20g、pH7.0;(2)、液体发酵培养基:干酪素5g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、pH7.0。本发明一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439)菌株,其菌落呈暗白色,大而扁平,表面粗糙,边缘不整齐有毛茸状枝条,透明性差,稍黏稠,易挑取;显微观察,其菌体多呈长杆状,单个较多,芽孢可见,有少数两连杆或三连杆链状现象。本发明的一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439)菌株最佳培养条件为:(1)、固体斜面培养,温度40-45℃,培养48h;(2)、液体发酵培养:接种1环活化后的固体斜面菌种,温度40-45℃,100-130r/min摇床培养48h。本发明的一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439)菌株具有温度耐受性,45℃条件下时仍然表现出高产特性。本发明的一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439)菌株,其菌种来源于安徽金种子酒业股份有限公司生产的浓香型中高温大曲,采用热处理产芽孢、酪蛋白选择培养基、高温培养等方法分离筛选得到。将菌株Nxzd4的16SrDNA测序,在GeneBank的比对结果显示,Nxzd4与地衣芽孢杆菌(EU304950)的16SrDNA基因的相似性达到100%。结合菌体形态特征的鉴定结果,将菌株Nxzd4确定为地衣芽孢杆菌。2016年5月12号,该菌株已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),(邮编100101),保藏编号为CGMCCNO.12439。本发明的一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439),可产耐温淀粉酶、中性蛋白酶等,兼具有温度耐受性,其有益效果是适应于芝麻香型白酒的“高温堆积、高温发酵”原酒酿造过程中的温度变化要求,应用于酿酒细菌麸曲、强化大曲等的生产,具有一定的液化力、糖化力及蛋白质水解力等,有利于原料中淀粉的糖化和蛋白质的分解,进而促进美拉德反应的发生,生成多种酮、醛、醇及呋喃等一系列风味物质,有助于提高原酒的品质和出酒率。具体实施方式实施例1本发明一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439),其菌种来源于安徽金种子酒业股份有限公司生产的浓香型中高温大曲,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,(邮编100101),保藏编号为CGMCCNO.12439。具体为:(1)、酪蛋白选择培养基配制:先配制酪蛋白选择培养基,其组成:蛋白胨10g、牛肉膏3g、干酪素4g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、pH7.4-7.6、pH7.0;称量溶解后,121℃灭菌30min,固体培养基加2%琼脂。(2)、菌株的分离与形态观察:在装有100mL无菌水的三角瓶中,加入1.0g经研磨过的大曲样品,棉塞封口,65℃水浴加热10min,冷却稀释10-2、10-3、10-4、10-5倍。将稀释液涂布于培养基平板上,55℃倒置培养24h,观察菌落特征,选取差异明显、透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落备筛选、纯化,重复纯化2-3次,筛选到一株高产蛋白酶的嗜热菌株Nxzd4。经形态观察,Nxzd4其菌落呈暗白色,大而扁平,表面粗糙,边缘不整齐有毛茸状枝条,透明性差,稍黏稠,易挑取;显微观察,其菌体多呈长杆状,单个较多,芽孢可见,有少数两连杆或三连杆链状现象。(3)、菌株的16SrDNA序列测定:菌株Nxzd4的16SrDNA序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司(上海市浦东新区康新公路3399号时代医创园3号楼,021-51875086)完成。在GeneBank的比对结果显示,菌株Nxzd4与地衣芽孢杆菌(EU304950)的16SrDNA基因的相似性达到100%;结合菌体形态特征的鉴定结果,将菌株Nxzd4确定为地衣芽孢杆菌。2016年5月12日该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,(邮编100101),保藏编号为CGMCCNo.12439。实施例2本发明的一株产蛋白酶嗜热地衣芽孢杆菌Nxzd4(CGMCCNO.12439)具有较高温度耐受特性,具体为:(1)、菌种活化:将保藏的一株产蛋白酶嗜热细菌(CGMCCNO.12439)挑取1接种环在固体斜面培养基划线,再置于恒温培养箱内40-45℃培养48h,得一级活化菌种。(2)、二级液体菌悬液:制备液体培养基,分装灭菌,冷却后接种1接种环步骤(1)所得的一级活化菌种,再置于40-60℃温度梯度下,110r/min摇床上培养48h,得二级液体菌悬液;其中,液体培养基:干酪素5g、蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL、pH7.0。(3)、中性蛋白酶活力检测:按照GB/T28715-2012分光光度法,测定二级液体菌悬液的中性蛋白酶活力,如表1所示:表1.不同温度条件下产蛋白酶嗜热细菌CGMCCNO.12439的中性蛋白酶活力温度(℃)4045505560中性蛋白酶活力(u/ml)83.78±0.02112.05±0.0910.75±0.094.71±0.072.04±0.03当前第1页1 2 3 
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