一种嗜温高温放线菌及用途的制作方法

文档序号:12248553阅读:1378来源:国知局

本发明属于生物技术领域,具体来说涉及嗜温高温放线菌,同时还涉及该嗜温高温放线菌在产土味素类物质中的用途。



背景技术:

大曲是酿酒用的一种糖化剂和发酵剂,大曲的制作具有生料制作、开放制作、机械化程度低和操作简单四个特点,开放式制曲最大限度网罗了环境中的微生物,以增加大曲培养过程中微生物的总量;其培养具有自然培养、堆积升温、季节性强、易培养、周期长、菌酶共存等特点。

目前申请人采用第二代高通量测序的方法对贵州省白酒企业的酱香大曲的微生物多样性进行了分析,采用免培养的方法分析发现高温放线菌属的相对含量占大曲中原核微生物的34.30%,高于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),目前其分类地位属于细菌域( Domain Bacteria),厚壁菌门( Phylum Firmicutes),芽孢杆菌纲( Class Bacilli) ,芽孢杆菌目(Order Bacillales),高温放线菌科( Thermoactinomycetaceae)。贵州的酱香型白酒是典型的高温固态发酵体系,发酵工艺有三高的特点。长期以来通过纯培养方法对芽孢杆菌属(Bacillus)的种类、功能及代谢途径进行大量研究,并确定芽孢杆菌在白酒发酵过程中的产酶、产酱香风味物质等重要作用。但是高温放线菌属目前仅在芝麻香型白酒的高温大曲中分离鉴定到一株Thermoactinomyces vulgaris 。目前在酱香高温大曲中高温放线菌的发现及其功能探究方面研究较少,没有相关文章或专利。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供的一种产土味素类物质的嗜温高温放线菌。

本发明的另一目的在于提供该嗜温高温放线菌在产土味素类物质中的用途。

本发明的一种嗜温高温放线菌,其形态特征:该菌株在ISP2培养基上,50℃培养3d,菌落直径6~7mm,菌落圆形,基内菌丝淡黄色,气生菌丝白色,菌落凸起、干燥致密,菌落不易挑起,不透明,有皱褶,孢子白色,无可溶性色素产生,扫描电镜观察菌丝体上形成单个孢子,孢子无柄或直接着生在菌丝体上,孢子单个侧生于菌丝体两侧。该菌种于2016年5月30日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址:中国 武汉 武汉大学),保藏号:CCTCC M2016296,名称为:嗜温高温放线菌FBKL4.005(Thermoactinomyces thalpohillus strain FBKL4.005)。

(一)嗜温高温放线菌(Thermoactinomyces thalpohillus strain)FBKL4.005的分离步骤:

从贵州某酒厂酒曲中,称取保存曲粉样品10g,按照样品与CaCO3质量比为10:1的比例在无菌烧杯混合,添加2ml无菌水,空气湿度30%,在28℃富集培养1周;将富集后的大曲样品放入盛90ml无菌CMC水溶液(2.5g/L)并带有玻璃珠的三角烧瓶中,50℃、200r/min振荡30min;将大曲样品悬液在50℃水浴锅中热处理10min,取1ml样品悬液进行10倍梯度稀释分别由10-4、10-5、10-6和10-7稀释度的样品悬液中各取0.2ml涂布于分离培养基上,50℃静止培养3d,挑取单菌落进一步筛选,斜面培养基上保藏。

(二)培养嗜温高温放线菌采用的培养基:

分离筛选培养基:

GTY培养基(g/L):葡萄糖10.0g、胰蛋白胨0.5g、酵母浸粉2.0g、CaCO3 1.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml、pH7.2-7.4,115℃灭菌20min,放置培养基冷却到50℃加入经0.22um的无菌滤膜过滤的新生霉素(30mg/L)和制霉菌素(20mg/L)混匀倒平板;

保藏培养基:

ISP2培养基(g/L):酵母膏4g、麦芽汁10.0g、葡萄糖4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml、pH7.0-7.2。

固态发酵培养基:

高粱麦粒培养基:高粱与小麦质量比为1:1,小麦高粱的粉碎颗粒与整粒比为1:1,加90℃热水(加水量40%)搅拌均匀,润粮1d,200g/瓶装瓶,121℃灭菌20min。

(三)菌种的保种和传代:

1、菌种保藏培养基:

ISP2培养基(g/L):酵母膏4g、麦芽汁10.0g、葡萄糖4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml、pH7.0-7.2。

2、保存方法有4种:

①传代培养高温放线菌菌种保存法:将高温放线菌接种于ISP2斜面培养基上,置恒温箱50℃培养3d后,将橡胶塞用灭菌固体石蜡熔封,移至4℃冰箱保存,一般高温放线菌在4℃冰箱内可以保存一个月,需定期移植。

②砂土管高温放线菌菌种保存法:取清洁的海沙,用1mol/L的氢氧化钠溶液清洗,然后再用1mol/L的盐酸溶液清洗,在后用流水冲洗。分装试管,约2-3厘米深,干热灭菌,加入高温放线菌培养液1mL左右与砂土混匀,置真空干燥管内干燥,待完全干燥后熔封保存。

③真空冷冻干燥高温放线菌菌种保存法:将待保存的微生物细胞或者孢子悬浮在合适的保护剂中,预先将细胞冷冻,使水冻结,然后在真空条件下,使冰升华以除去大部分水,残留的一些不冻结的水分,再通过蒸发从细胞中除去。

④液体石蜡法:亦称矿物油保藏法,将高温放线菌菌种接种在适宜的斜面培养基上,最适条件下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡,使其覆盖整个斜面,再直立放置于低温(4℃)干燥处进行保存的一种菌种保藏方法,是定期移植保藏法的辅助方法。

(四)菌种的生态特征:

该菌形成的菌落在ISP2培养基上,50℃培养3d,菌落直径6~7mm,菌落圆形,基内菌丝淡黄色,气生菌丝白色,菌落凸起、干燥致密,菌落不易挑起,不透明,有皱褶,孢子白色,无可溶性色素产生,扫描电镜观察菌丝体上形成单个孢子,孢子无柄或直接着生在菌丝体上,孢子单个侧生于菌丝体两侧。

(五)菌种的培养特性

(1)培养温度45℃~55℃,最适温度45℃~50℃;

(2)培养pH 6~8;最佳范围为7~7.2。

基内菌丝由有分支的长菌丝组成,菌丝直径约为500nm;气生菌丝由长菌丝及长度为1um~2um的短菌丝组;孢子单个无柄,多为圆形,表面光滑,多直接着生在菌丝体两侧;偶见着生在很短孢子梗顶端。根据根据伯杰细菌鉴定手册描述,综合形态特征及 16S rDNA系统发育分析,嗜温高温放线菌FBKL4.005(Thermoactinomyces thalpohillus strain FBKL4.005)。

本发明的嗜温高温放线菌在产土味素类物质中的用途。

本发明与现有技术相比,具有明显的有益效果,从以上技术方案可知:本发明的嗜温高温放线菌FBKL4.005对温度、pH等自然环境条件的适应范围广,对不良环境的耐受力强,容易培养和保存及工业化生产,生产成本低,不污染环境,不破坏生态平衡。

具体实施方式

实施例:

本发明的嗜温高温放线菌(Thermoactinomyces thalpohillus)分离方法:

从贵州某酒厂酒曲中,称取保存曲粉样品10g,按照样品与CaCO3质量比为10:1的比例在无菌烧杯混合,添加2ml无菌水,空气湿度30%,在28℃富集培养1周;将富集后的大曲样品放入盛90ml无菌CMC水溶液(2.5g/L)并带有玻璃珠的三角烧瓶中,50℃、200r/min振荡30min;将大曲样品悬液在50℃水浴锅中热处理10min,取1ml样品悬液进行10倍梯度稀释分别由10-4、10-5、10-6和10-7稀释度的样品悬液中各取0.2ml涂布于分离培养基上,50℃静止培养3d, 挑取单菌落进一步筛选,斜面培养基上保藏。

该菌形成的菌落在ISP2培养基上,50℃培养3d,菌落直径6~7mm,菌落圆形,基内菌丝淡黄色,气生菌丝白色,菌落凸起、干燥致密,菌落不易挑起,不透明,有皱褶,孢子白色,无可溶性色素产生,扫描电镜观察菌丝体上形成单个孢子,孢子无柄或直接着生在菌丝体上,孢子单个侧生于菌丝体两侧。

试验例:产香能力测定

将菌株接种于GTY液体培养基,50℃振荡培养1d,取10ml接种于盛有200g高粱麦粒培养基的三角瓶中,50℃恒温静置培养5d,进行感官评定,土味较浓。

通过GC-MS对发酵产物的易挥发性物质进行分析,发酵试验后,实验组物质成分与对照组差距明显,产物增多。其中土味素类物质含量为38.83%。

以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,任何未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

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