一种防治大豆疫病的生防放线菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种防治大豆疫病的生防放线菌菌株及其应用，属于农作物病害防治技术领域。

背景技术：

大豆疫病是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）侵染引起的大豆生产上的毁灭性病害之一，该病害在大豆的整个生育期均可发生，但尤其以苗期发病最为常见，如果伴有阴雨则易引起病害大面积的流行而造成产量严重下降甚至绝收，防治难度较大，严重影响我国大豆产业发展，造成重大的经济损失。

目前，大豆疫病的主要防治方法是栽培抗病品种和喷施化学农药。然而大豆疫霉菌群体会每年都发生巨大的变化，抗性品种抗性一般几年后就会逐渐丧失。目前，科学家已经成功克隆了13个显性单抗病性基因。虽然单基因抗性较强，但是其对大豆疫霉菌选择压力较大，易使新的生理小种成为优势种群，使大豆品种抗性慢慢丧失。化学杀菌剂一度成为控制大豆疫病的主要措施，其中甲霜灵的应用最为广泛。但是，甲霜灵的作用靶标非常单一，大豆疫霉菌在进化过程中极易产生抗性突变，在很多地区抗性菌株频率超过了50%，抗药性问题日益突出。不仅如此，化学农药的大量使用还给生态环境、人类健康等造成严重威胁。因此，研发出可替代化学杀菌剂的生物源杀菌剂用于大豆疫病的防治已刻不容缓。

放线菌（Actinomycetes）是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，广泛分布于自然界中。目前从微生物中发现的约8000 种生物活性物质当中，近70% 是由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中应用广泛，如中生菌素、阿维菌素等。土壤拮抗放线菌具有对环境友好、效果持久、针对性强等优点，展现出良好的应用前景。因此从烟田根围土壤分离获得对烟草青枯病菌具有拮抗作用的放线菌，对该病害的防治具有重要意义，符合农业的可持续发展要求。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对目前大豆疫病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治大豆疫病的生防放线菌及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治大豆疫病的生防放线菌St3，经形态观察、培养特征观察和分子生物学研究鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，已于2014年3月24月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.8961。

所述的生防放线菌St3菌剂的制备过程如下：

将所述的菌株接种于高氏一号液体培养基中，28 ℃，180 r/min，培养2 d后，制成种子液。取6ml种子液接种于发酵培养基中。经优化后得到的发酵培养基配方为：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黄豆粉2%、NaCl 0.3%、CaCO₃ 0.2%，其余为水。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量10% ( v /v)、装瓶量60mL /250mL、发酵培养基初始pH值8.0、28℃，200 r/min，培养5 d，制成浓度为10⁸CFU/ml的St3菌株发酵液。

所述的生防放线菌St3在防治大豆疫病中的应用方法如下：

可在大豆苗期或成株期灌根使用，每株50ml。连续使用2-3次，每次间隔10天左右。该菌剂也可与有机肥混合配制成菌肥使用。

本发明有益效果：

本发明筛选出的生防放线菌St3能够明显抑制大豆疫霉菌的生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药的使用带来的一系列问题，对减少农业污染，且能有效防治大豆疫病。

本发明生防放线菌分离自大豆根围土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。

本发明生防放线菌菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株St3气生菌丝和孢子丝形态（光学显微镜下40×）。

图2为菌株St3孢子形态（电子显微镜7000×）。

图3为菌株St3发酵液对大豆疫霉菌的平板抑菌效果图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1 拮抗放线菌的分离

具体过程如下：

1、土壤样品的采集

从福建省龙海市榜山镇南苑村采集不同大豆地块5-10cm深处的根围土壤，分装标记后带回实验室，待自然风干后分离。

、放线菌的分离

采用平板稀释法进行分离。称取土壤样品10g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置5分钟，依次稀释10倍，分别配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.1ml加到高氏一号培养基（加入终浓度为50mg /L 的K₂GrO₇）平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到85株放线菌。

实施例2 菌株St3的鉴定

1、形态特征观察

将菌株St3划线接种在高氏一号培养基上，以45度角斜插入无菌盖玻片，28℃培养7d 后，取出盖玻片在光学显微镜和电子显微镜下观察菌丝和孢子的形态特征。发现菌株St3 的孢子丝螺旋状，常成簇生，孢子丝断裂成分生孢子，孢子椭圆形，表面粗糙（图1和图2）。

、培养特征观察

采用《链霉菌鉴定手册》推荐的8种培养基，将菌株St3 于28℃培养7-10d后观察菌体生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝的颜色以及是否产生可溶性色素。菌株St3在高氏一号培养基、察贝克培养基、PDA培养基、葡萄糖酵母膏培养基和燕麦培养基上生长良好，基内菌丝和气生菌丝发育良好；而在克氏一号培养基、淀粉铵培养基和葡萄糖天门冬素培养基上生长较差，在上述8种培养基上均无可溶性色素产生(表1)。根据以上形态特征分析，对照链霉菌鉴定手册，将St3初步鉴定为链霉菌粉红孢类群。

表1 菌株St3在不同培养基上的培养特征

3、16S rDNA 序列分析

基因组提取试剂盒提取菌株St3基因组DNA后，采用通用引物F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，进行 16S rDNA 的PCR扩增。回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，序列全长为1555 bp（请见序列SEQ ID NO.1）。将所得序列提交到GenBank 数据库进行BLAST 分析比对，发现与St3同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取12个典型菌株的16S rDNA 序列用MEGA 5.0 软件构建系统发育树。结果表明，菌株St3与Streptomyces graminearus属于同一分支，其中与菌株Streptomyces graminearus相似性达到99.8%，并结合形态学特征和培养特征，将菌株St3 鉴定为禾粟链霉菌(Streptomyces graminearus)。

实施例3 St3菌株发酵工艺的优化

将上述菌株接种于高氏一号液体培养基中，28 ℃，180 r/min，培养2 d后，制成种子液。取6ml种子液接种于发酵培养基中。通过对碳源、氮源的筛选以及营养条件单因子试验和正交试验后，得到该菌株的最佳发酵配方为：淀粉2wt.%、葡萄糖1.5 wt.%、黄豆粉2 wt.%、NaCl 0.3 wt.%、CaCO₃ 0.2 wt.%，其余为水。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量10% ( v /v)、装瓶量60mL /250mL、发酵培养基初始pH值8.0、28℃，200 r/min，培养5 d，得到浓度为10⁸CFU/ml的St3菌株发酵液。

实施例4 菌株St3拮抗测定

采用平板对峙培养法，将菌株St3对大豆疫霉菌作拮抗测定，首先在胡萝卜培养基平板中央接入大豆疫霉菌丝块，待大豆疫霉菌菌落长至3cm时，在菌落4周点接上菌株St3，25℃下培养5天后测量菌株St3对大豆疫霉菌的抑菌带宽度，实验结果筛选测定表明菌株St3对大豆疫霉菌具有较好的拮抗作用（图3）。

实施例5 菌株St3发酵液防效试验

大豆品种为毛豆75-3，实验地为常年大豆疫病发生地。待播种出苗后7-10天，每株苗浇灌50 ml St3菌株发酵液（10⁸个孢子/ml），开花期再浇灌一次100 ml St3菌株发酵液。以50%安克可湿性粉剂800倍液灌根处理作为农药对照，以发酵培养基和清水处理的植株作为空白对照。每个处理10株苗，每处理3次重复。待发病后每天调查发病情况，统计发病率和病情指数，直至清水对照发病率达到80%以上时结束实验。

病情分级标准如下：

0级：接种部位无变化或稍变褐；

1级：接种部位产生病斑，病斑面积占茎部面积的1/4以下；

3级：接种部位病斑面积占茎部总面积的1/4～1/2左右；

5级：接种部位病斑占茎部面积的1/2以上；

7级：接种部位病斑连片，已形成绕茎现象，但植株并没萎蔫或枯死；

9级：植株萎蔫或枯死。

病情指数（%）=[∑病级数×该病级植株数)／(最高病级数×总植株数)]×100%

防治效果（%）=[(对照病情指数－处理病情指数)／对照病情指数]×100%（对照指清水对照处理）。

实验结果表明（表2），供试放线菌St3发酵液能够显著降低大豆疫病的病情指数，防治效果高达85.02%，高于化学农药50%安克可湿性粉剂800倍液的防治效果80.81%。另外从表中还可以看出，发酵培养基处理的病情指数略低于清水对照处理的病情指数，但两者差异不显著。温室盆栽实验结果说明，St3菌株能够有效防治大豆疫病，展现出良好的应用潜力。

表2 放线菌St3发酵液对大豆疫病的防治效果

注：同列不同小写字母表示数值间差异显著（P <0.05）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种防治大豆疫病的生防放线菌菌株及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1537

<212> DNA

<213> 生防放线菌St3的16SrDNA序列

<400> 1

ctcggtaccc ggggatcctc tagagattag agtttgatcc tggctcagga cgaacgctgg 60

cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacga tgaaccacct tcgggtgggg attagtggcg 120

aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc ctgcactctg ggacaagccc tggaaacggg 180

gtctaatacc ggatactgac ctgccaaggc atcttggcgg gtcgaaagct ccggcggtgc 240

aggatgagcc cgcggcctat cagcttgttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgacg 300

ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac actgggactg agacacggcc cagactccta 360

cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg 420

tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcagca gggaagaagc gaaagtgacg 480

gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg 540

caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gagctcgtag gcggcttgtc gcgtcggttg 600

tgaaagcccg gggcttaacc ccgggtctgc agtcgatacg ggcaggctag agttcggtag 660

gggagatcgg aattcctggt gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg 720

gcgaaggcgg atctctgggc cgatactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca 780

ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacggtgggc actaggtgtg ggcaacattc 840

cacgttgtcc gtgccgcagc taacgcatta agtgccccgc ctggggagta cggccgcaag 900

gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggcttaattc 960

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ccccccttgt ggtcggtgta caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1080

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcccgtg ttgccagcaa ctcttcggag 1140

gttggggact cacgggagac cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag 1200

tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggccggta caatgagctg 1260

cgataccgca aggtggagcg aatctcaaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca 1320

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cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac acccgaagcc 1440

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