一种放线菌菌株KN37及其应用的制作方法

本发明属于生物工程
技术领域：
，涉及微生物及其应用，具体涉及一种隶属于链霉菌属的放线菌菌株KN37，以及其在抑制多种农作物病原菌的应用。
背景技术：
：新疆优越的自然条件使其在农产品生产方面具有先天的优势。种植业是新疆农业中的主要产业，占农业总产值的76％，是增加农业收入的主要来源。新疆种植作物主要包括粮食类、油料类、棉花类、蔬菜类、瓜果类和其他经济作物。然而，植物病害严重威胁着农作物的正常生产，几乎每种农作物都受到多种病原真菌的危害。据统计，全世界每年因植物病害造成的经济损失高达20000亿美元，其中仅蔬菜作物一项每年的经济损失就可达到2000亿美元。我国每年因植物病害造成的损失也是难以计数的，尤其是新疆地区。如新疆棉花每年因病害损失皮棉约36万吨，市价约70亿元。植物病害造成新疆地区加工番茄的损失同样巨大，每年造成经济损失达30亿元之多。因此，植物病害的防治一直以来都是困扰农业生产的一大难题。近些年，化学农药的大量使用导致农产品出口受限、抗药性、环境污染等问题的产生。因此，开发新型高效、广谱、低毒、环保的杀菌剂(微生物药剂)一直是当今农药研究的难点和热点。技术实现要素：本发明提供一种放线菌菌株KN37，菌株KN37的发酵液可抑制多种农作物病原菌，可用于开发成新型高效、广谱、低毒、环保的微生物杀菌剂。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种放线菌菌株KN37，是发明人在新疆喀纳斯地区采集的土壤中分离得到的一种放线菌。该菌株(生物材料)的保藏信息为：名称：Streptomycessp.KN37，以下简称为KN37；保藏编号：CGMCCNo.13160；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏时间：2016年10月27日。本发明通过16SrDNA序列方法对菌株KN37进行了分类鉴定。提取此菌的DNA，扩增16SrDNA的序列。从菌株KN37与链霉菌已有效发表种16SrDNA序列构建出的系统发育树可以获知，菌株KN37归属于链霉菌属。进一步地，本发明给出了菌株KN37的种子培养基及其培养条件。其培养条件为：在28℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养36h；所述培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化钠6g/L、pH值7.4。同时，本发明还结合形态学特征对菌株KN37进行了分类鉴定。将菌株KN37接种在培养基上，呈现的形态学特征为：菌落绒毛状，菌落的颜色为白色，在培养基中基内菌丝无横隔、不断裂，气生菌丝生长旺盛，孢子柱形，表面光滑，不产生可溶性色素。结合菌株形态观察、培养特性及16SrDNA的鉴定结果，本发明所述放线菌菌株KN37隶属于链霉菌属，因而本专利申请发明人将其命名为Streptomycessp.KN37。另一方面，本发明还给出了所述放线菌菌株KN37在生产广谱抗菌活性物质的用途。所述广谱抗菌活性物质来源于菌株KN37经液体发酵培养后的发酵液，所述发酵培养条件为：在28℃、180rpm条件下摇床培养7d；培养基组成为：1％豆粉浸汁1L、葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化钠2g、碳酸钙2g，pH自然。根据试验数据，所述菌株KN37的发酵液可抑制多种农作物病原菌。优选地，所述菌株KN37的发酵液用于抑制葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄叶霉病菌(Fulviafulva)的生物活性。鉴于放线菌菌株KN37发酵液的生物活性，所述菌株KN37的发酵液制备用于防治农作物病害的微生物药剂，即本发明所述杀菌剂。与现有技术相比，本发明至少具有下述的有益效果或优点：(1)本发明提供一种新的放线菌菌株KN37。该菌株可作为研制高效、广谱、低毒、环保的微生物杀菌剂的生物材料，菌株KN37的发酵液能够直接用于杀菌物质抑制多种农作物病原菌。尤其是，菌株KN37的发酵液对葡萄灰霉病菌、番茄早疫病菌、棉花枯萎病菌、番茄叶霉病菌具有较好的抑制作用。(2)本发明优化了菌株KN37种子培养基及其培养条件。其培养条件为：在28℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养36h；所述培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化钠6g/L、pH值7.4。(3)本发明给出了菌株KN37具有杀菌活性的发酵液的制备条件。其发酵培养条件为：在28℃、180rpm条件下摇床培养7d；培养基组成为：1％豆粉浸汁1L、葡萄糖10g、蛋白胨3g、氯化钠2g、碳酸钙2g，pH自然。附图说明图1是本发明所述放线菌菌株KN37的菌落形态图。图2是本发明所述放线菌菌株KN37与相关种16SrDNA序列的系统发育树。具体实施方式以下将结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细阐述。实施例1：菌株KN37的分离和鉴定(1)放线菌菌株KN37是从新疆喀纳斯地区采集的土壤中分离得到一种放线菌。该菌株KN37的种子培养条件为：在28℃、120rpm条件下，在培养基中摇床培养36h；所述培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母膏2g/L、酸水解酪蛋白2g/L、氯化钠6g/L、pH值7.4。(2)采用16SrDNA基因测序法对放线菌菌株KN37进行分类鉴定。16SrDNA序列测定委托上海生工生物工程股份有限公司进行。具体测序方法如下：用溶菌酶法从新鲜菌体中提取基因组DNA，采用通用引物(27F和1492R)进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测后测序。经测定，该菌株KN37的16SrDNA序列如下所示：ACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACACGCTCAGGCATCTGAGTGTGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGA从菌株KN37与链霉菌已有效发表种16SrDNA序列构建出的系统发育树(图2)可以看出：菌株KN37与参比菌株的16SrDNA序列相似性介于98～99％之间，与Streptomyceskanamyceticus的系统发育关系最为密切，其之间的序列相似性为99％，这与目前属的界定中16SrDNA序列相似性不低于95％的标准相符合。但该菌株在系统进化树上不与任何已知菌种相聚，而是以较高的进化差异独立成枝，说明该菌株与所有参比模式菌株在进化上均存在较大差异。(3)放线菌菌株KN37的形态鉴定菌株KN37在大多数培养基上生长良好(见表1)，在高氏培养基上菌落绒毛状，白色(图1)，基内菌丝无横隔，不断裂，气生菌丝生长旺盛，孢子柱形，表面光滑。KN37菌株在各个培养基上均无可溶性色素产生。表1，菌株KN37的培养特征培养基基内菌丝气生菌丝菌落生长情况淀粉甘油培养基白色白色+PDA培养基白色白色+++ISP4培养基白色白色+++察氏培养基白色白色+ISP5培养基白色白色+++LB培养基浅黄色浅黄色+++牛肉膏蛋白胨培养基白色乳白色++Bennett培养基白色白色+++高氏一号培养基浅黄色白色+++注：++为正常生长；+为生长状况较差；+++为生长旺盛。菌株KN37的生理生化特性和碳源利用情况如下：菌株KN37明胶液化和硝酸盐还原反应均为阳性；菌株KN37可利用葡萄糖、D-核糖、蔗糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和纤维素作为唯一碳源，但不能利用D-果糖和肌醇。实施例2：菌株KN37的生物活性及其应用(1)菌株KN37对病原菌的抑制活性利用生长速率法测定菌株KN37发酵液对番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、番茄叶霉病菌、番茄晚疫病菌、番茄细菌性斑点病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、辣椒疫霉病菌、苹果炭疽病菌、黄瓜炭疽病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、白菜黑斑病菌、玉米小斑病菌、烟草赤星病菌、稻瘟病菌、根腐病菌、立枯病菌等多种病原菌的抑制活性。结果参见表2所示，菌株KN37对大多病原菌均具有很好的抑制效果(表2)。表2，菌株KN37发酵液对18种病原菌的抑制作用病原菌抑制率％病原菌抑制率％番茄灰霉病菌90.26棉花黄萎病菌64.88番茄早疫病菌72.66辣椒疫霉病菌72.07番茄叶霉病菌74.02苹果炭疽病菌88.89番茄晚疫病菌85.98黄瓜炭疽病菌85.06番茄细菌性斑点病菌91.67油菜菌核病菌97.85棉花枯萎病菌50.62小麦赤霉病菌73.76水稻纹枯病菌35.79白菜黑斑病菌58.91玉米小斑病菌42.67烟草赤星病菌51.32稻瘟病菌69.42根腐病菌86.33(2)菌株KN37发酵液对番茄灰霉病的防治效果利用组织法测定KN37对番茄灰霉病的防治效果，结果参见表3显示，菌株KN37发酵液对番茄灰霉病具有很好的保护作用。表3，菌株KN37发酵液对番茄灰霉病的保护和治疗效果(3)菌株KN37发酵液对番茄病害的防治效果KN37菌株发酵液施用于大棚内的番茄后，番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄晚疫病、番茄叶霉病、番茄细菌性病害的发生率和危害程度菌显著降低(表4)。表4，菌株KN37发酵液对大棚番茄病害的防治效果病害名称防治效果％病害名称防治效果％灰霉病62.72早疫病61.53晚疫病58.43叶霉病71.66细菌性病害55.25根部病70.84根据本实施例结果表明，本发明所述的菌株KN37经过液体发酵培养，其发酵液中含有抑制常见农作物病原菌的物质，能够显著减轻病害的发生，有望开发成为一种新型的防治农作物病害的微生物药剂。上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。序列表<110>石河子大学<120>一种放线菌菌株KN37及其应用<160>1<210>1<211><212>RNA<213>放线菌菌株KN37<400>1ACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACACGCTCAGGCATCTGAGTGTGTTGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGAAGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGAAGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGA当前第1页1 2 3