专利名称：一种来源于放线菌(Streptomyces rameus L2001)的耐热木聚糖酶基因及其产物木聚糖 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种来源于放线菌(Streptomyces rameus L2001)的耐热木聚糖酶的基因及其产物木聚糖酶XynA的应用。
背景技术：
木聚糖(xylan)主要是由五碳的D-卩比喃型木糖(xylopryanose)通过β-1,4_糖苷键以不同聚合度形成的不均一多糖，是植物半纤维素主要成分，是构成植物细胞壁的重要组成成分，占被子植物细胞壁干重的15% -30%,占裸子植物细胞壁干重的7% -12%，木 聚糖广泛存在于植物根、茎、叶、花和果实中，占植物总的生物量的20%-40%，是自然界中仅次于纤维素的最丰富的可再生有机资源。木聚糖除了含有聚合度不同的木糖外，还同其它多糖以多种糖苷键共价交联，同时还存在大量的支链取代基，完全降解需要一系列的酶协同作用，其中起主要作用的是β-1,4-内切木聚糖酶，以内切的方式破坏木聚糖主链的糖苷键，释放寡聚木糖和少量的木糖単体，其次需要β木糖苷酶，作用寡聚木糖的还原端，释放木糖単体，另外还需要降解支链的 α -L-呋喃阿拉伯糖苷酶(a -L-arabinofuranoside, EC 3. 2. I. 55)，a -D-葡萄糖醒酸酶(α -D-glucuronidase,EC 3. 2. I. 139)，こ酸木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase,EC
3.I. I. 72)和酹醒酸酯酶(phenolic acid esterase)(包括阿魏酸酯酶和p_香豆酸酯酶)等木聚糖酶的參与。木聚糖酶目前被报道广泛存在于动物植物中，包括真菌，细菌，藻类，甲壳动物，蜗牛，藻类利陆生植物，其中丝状真菌，细菌以及放线菌是主要的生产者，包括丝状真菌的木霉属(Trichoderma sp·),腐质酶属(Humicola sp·),链抱霉属(Neurospora sp.),曲霉属(Aspergillus sp·),祿抱属(Fusarium sp·),青霉属(Penicillium sp.)和胶霉属(Gliocladium sp.)。细菌的放线菌包括 S. actuosus, S. cyaneus, S. halstedii,b.matensIs, b. 0丄Ivaceoviridis， b. roseisc丄eroticus， S. thermoviolaceus,b. viridosporus.木聚糖酶具有广泛的应用价值和前景，其主要在造纸，饲料和食品エ业得到广泛应用，在纺织、生物能源、化妆品、医药保健品等领域也有良好的应用前景。在造纸エ业中，传统的化学漂白法采用氯化物在碱性条件下去除木质素，一方面产生大量的有毒利强致癌化合物，ニ是在后处理过程中又消耗大量的能源，木聚糖酶的应用能够增强漂白效果和減少后续氯化物的用量，实际使用不仅大大降低了环境污染，还改善了纸张的性能，提高了纸张的质量。在分离自然的木聚糖酶的工作基础上，研究人员也在通过生物工程和基因工程的方法对木聚糖酶进行改造，试图进一步获得更适合造纸エ业生产所用的木聚糖酶。在饲料エ业中，非反刍动物消化道中由于缺少木聚糖酶等消化半纤维素酶，对饲料中丰富的半纤维素物质无法利用，造成饲料利用效率低，动物消化道疾病増加以及粪便污染环境等不良后果，在饲料中添加木聚糖酶等分解半纤维素的酶类，可以提高动物对饲料的利用效率，减少动物的肠道疾病，提高成活率，减少粪便污染。在食品エ业中，木糖的甜度是蔗糖的40%，在人体内不会造成葡萄糖的水平升高，因此可以作为糖尿病患者和肥胖患者的甜味剂，此外，作为难发酵型糖，不容易造成龋齿，因此也是儿童食品的甜味剂，在面包生产上，添加木聚糖糖浆，可以改良面包色泽，増加香味，保持面包水分等效果，这些都是木聚糖酶在食品エ业中的应用方向。在纺织エ业中，木聚糖酶在苎麻脱胶中起重要作用，作为优良的纺织原料，苎麻在我国纺织产业中有一定的地位，在生产过程中，重要的一歩是脱胶，传统方法采用高温强酸强碱法，污染环境，且破坏纤维降低品质，我国科研人员将木聚糖酶和果胶酶配合使用，创造出酶法脱胶法，改善了劳动环境，提高了产品品质，而且大大减轻了环境污 染。在能源エ业中，由于木聚糖是地球上仅次于纤维素的第二大可再生有机物，在生物质能源的生产上具备了潜在应用前景。在化妆品，木聚糖酶作用木聚糖，产生的寡聚合的木聚糖，具有很好的保水效果，可用于化妆品保持皮肤水分。在制备医药和保健品种行业中，木聚糖酶作用木聚糖产物単独或者和其它寡聚糖(如果聚糖)混合服用，产生的寡聚合的木聚糖可以改善人体肠道的菌群平衡，有助于良性细菌的繁殖，改善人的消化功能。
发明内容
本发明从来源于放线菌(Streptomyces rameusL2001)的耐热木聚糖酶获得木聚糖酶基因多核苷序列如SEQIDN01所示CCATAGGACGCGCTCAGCGTCTCGGCGATCTCCTCGTCGGCCTGCGCCACGGTGCGGCGGATCGTACGGTGCCGAGCAAGGGCCTGTCGGCGGGGTCGCTCTCGMGGGGCAGCGCCGGACATGGCCGGGCCCGTAGGCCTCGAGTCCGGCCGTCGCCACGCGGCGCAGCTCCTGTGTCGTCGAAACATTCGAAACCCAGTGTGGGGACTTCGGCGTCTCCATGGAGTGTTCCGGGATGTTCCTAGAGGGATCTCCTCACTCATGCCGATTCATCAGCGGACACGTAGCGACGGTCGCGCTAGGACGCAGACGAATGTTTCGAAATATCGACCGAAAGTGTTGACAGATGACATGGCCAGGCCAACACTCCCCATCACGTCACACCCCACCCGTCGCACAAGGAGGAAGTACGACATGAATCCGCTCGACCATGCGACGAGCCGCAGGGCCGCCTGCGCGCTGCTGCTCGGCACCGCGGCCGGACTGGCCCTGCCCGGCACCGCCCGTGCCGCCACGGTCGTCACCACGAACCAGACCGGCACCGACAACGGCTTCTACTACTCGTTCTGGACCGACGCGCAGGGCACGGTCTCGATGACCCTGGGCTCCGGTGGCAACTACAGCACCAGCTGGCGCAACACCGGCAACTTCGTGGCCGGCAAGGGCTGGAGCACCGGCGCCCGCAGGAACGTGACCTACTCCGGCAGCTTCAACCCGTCCGGCAACGGCTACCTGTCGCTCTACGGCTGGACGTCGAACCCGCTCGTGGAGTACTACATCGTCGACAACTGGGGCACCTACCGGCCCACGGGGACGTACAAGGGCAGTGTCACCAGTGACGGCGGAACGTACGACATCTACCAGACGACGCGGTACAACGCCCCGTCCGTCGAGGGCACCAGGACCTTCAACCAGTACTGGAGCGTGCGGCAGTCGAAGCGCACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTCGACGCCTGGGCCCGCGCCGGGATGCCCCTCGGCAGCTTCGCGTACTACATGATCCTCGCGACCGAGGGGTACCAGAGCAGCGGCAACTCCAATATCACGGTGTCGTCGTGAGGACCGCACGACAGCTCGCGTTACGTCCGGCGGTGACCGCCGCCGTCGCCGCACCGGCCCTCGCCGCTACGCTCATCGTCGGAGCCGCCCCTCGCACGCGCACCCTTCCC本发明从来源于放线菌(Streptomyces rameus L2001)的耐热木聚糖酶获得木聚糖酶基因多肽序列如SEQ IDN02所示
MAGPVGLESGRRHAAQLLCRRNIRNPVWGLRRLHGVFRDVPRGISSLMPIHQRTRSDGRARTQTNVSKYRPKVLTDDMARPTLPITSHPTRRTRRKYDMNPLDHATSRRAACALLLGTAAGLALPGTARAATVVTTNQTGTDNGFYYSFWTDAQGTVSMTLGSGGNYSTSWRNTGNFVAGKGWSTGARRNVTYSGSFNPSGNGYLSLYGffTSNPLVEYYIVDNWGTYRPTGTYKGSVTSDGGTYDIYQTTRYNAPSVEGTRTFNQYWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWARAGMPLGSFAYYMILATEGYQSSGNSNITVSS本发明从来源于放线菌(Streptomyces rameusL2001)的耐热木聚糖酶获得木聚糖酶基因多肽序列如SEQ IDN03所示MNPLDHATSRRAACALLLGTAAGLALPGTARAATVVTTNQTGTDNGFYYS FffTDAQGTVSMTLGSGGNYSTSWRNTGNFVAGKGffSTGARRNVTYSGSFNPSGNGYLSLYGWTSNPLVEYYIVDNWGTYRPTGTYKGSVTSDGGTYDIYQTTRYNAPSVEGTRTFNQYWSVRQSKRTGGTITTGNHFDAWARAGM-PLGSFAYYMILATEGYQSSGNSNITVSS本发明从来源于放线菌(Streptomyces rameus L2001)的耐热木聚糖酶获得木聚糖酶基因信号多肽序列如SEQ ID N04所示MNPLDHATSRRAACALLLGTAAGLALPGTARA
图I为枝链霉菌L2001基因组DNA电泳照片。图2为图2编码木聚糖酶的保守序列。图3Tail_PCR过程简略图。其中Spl，Sp2为嵌套引物，根据核心序列设计的，LAD为兼并引物。图4-1为5'端侧翼序列扩增电泳照片。泳道1、2、3为Sp5,与不同LAD引物之间的组合进行的第三轮Tail-PCR扩增结
果O图4-2为:V端侧翼序列扩增电泳照片。泳道1、2、3为Sp3,与不同LAD引物之间的组合进行的第三轮Tail-PCR扩增结
果O图5为转基因木聚糖酶A酵母中木聚糖酶活性分析。图6为大肠杆菌表达木聚糖酶A的SDS-PAGE蛋白电泳图。I =Marker, 2-3 :含空载体大肠杆菌表达蛋白4_7 :含XylA表达载体的大肠杆菌表达蛋白。图7为比赤酵母表达木聚糖酶A的SDS-PAGE蛋白电泳图。I =Marker，2_5 :阳性毕赤酵母pPIC9K-XylA表达蛋白。
具体实施例方式本发明以下结合具体实例作进ー步说明，但并不是限制本发明。菌株大肠杆菌DH5 α和Transtetta (DE3)感受态细胞购自全式金公司；毕赤酵母菌株GS115购自invitrogen公司。载体T载体 pEASY-blunt simple 和 pEASY-simple Tl 购自全式金公司；pET_28a (+)和pET_32a购自Merk公司，毕赤酵母表达载体购自pPIC9K Invitrogen公司。、
生化试剂rTaq,ExTaq, EcoRI, EcoRV, AvrII, XhoI 和 T41igase 等购自 Takara 公司,KDO-plus购自Toyobo公司。溶菌酶购自Amresco公司。质粒小量提取试剂盒,质粒中量提取试剂盒，胶回收试剂盒购自Omiga公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。普通化学试剂氯仿，甲醇，こ醇，异丙醇，氯化钠，盐酸，冰醋酸等购自北京化学试剂厂，β -巯基こ醇，Tris, SDS,山犁醇，甘油，DMSO,卡那霉素，氨卞青霉素，考马斯亮蓝，过硫酸铵，丙烯酰胺，双丙烯酰胺等购自Amresco公司。桦木木聚糖购自Sigma公司。Tris-饱和酚，琼脂粉购自鼎国生物公司。琼脂糖购自西班牙Biowest公司。胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxford公司。刚果红，咪唑-邻苯ニ甲酸氢钾购自天津市文达稀贵试剂化工厂。
引物扩增木聚糖酶核心序列所用兼并引物正向引物Xyn-p I 序列5' -STBSTACTCSTTCTGGACSGA-3'反向引物Xyn-p2 序列5' -CCASGCGTCGAAGTGRTT-3'(注R = A/G, S = C/G, W = A/T, B = C/G/T, N = A/C/G/T)。T载体用测序引物M13+序列5' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3'M13-序列5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3'全长基因扩增引物xynA-pI 5/ -CCATAGGACGCGCTCAG-3'xynA-p2 5/ -GGGAAGGGTG CGCGTG-3'Tail-PCR 所用引物上游扩增引物sp5-l:5' -CGATTCATCAGCGGACACGTAGC-3'sp5-2 5/ -GATGTTCCTAGAGGGATCTCCTCACTCAT-3' sp5-3 5/ -GTCGAAACATTCGAAACCCAGTGTGG-3'下游扩增引物sp3-l:5' -CCACACTGGGTTTCGAATGTTTCGAC-3'sp3-2 5/ -CATGAGTGAGGAGATCCCTCTAGGAACAT-3'sp3-3 5/ -GCTACGTGTCCGCTGATGAA TCG-3'大肠杆菌表达载体引物正向长片段引物xynA-eLl :5' -CAGAATTCATGAATCCGCTCGACCATG-3'正向短片段引物xynA-eSl :5' -CAGAATTCACGGTCGTCACCACGAA-3'反向通用弓丨物xynA-eD 5' ~TACTCGAGTCACGACGACACCGTGA~3'毕赤酵母表达载体引物正向长片段弓丨物xynA-yLl 5' -CAGAATTCATGAATCCGCTCGACCATG-3'正向短片段引物xynA-ySl :5' -CAGAATTCACGGTCGTCACCACGAA-3'反向通用弓丨物xynA-yD 5' -TACCTAGGTCACGACGACACCGTGA-3'基因组DNA的提取放线菌基因组总DNA提取使用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，方法略做改进，裂解完全后的菌体，采用等体积的Tris-饱和酚/氯仿抽提2次，等体积的氯仿抽提一次再上拄，可以得到纯净和不容易降解的放线菌基因组总DNA(图I)。
兼并引物的设计将来源于放线菌Streptomyces rameus发酵液并经过纯化后的木聚糖酶的纯酶，进行N末端蛋白序列測定，测得了此酶N端15个氨基酸序列ATVVTTNQTGTDNGF(Ala-Thr-Val-Val-Thr-Thr-Asn-Gln-Thr-Gly-Thr-Asp-Asn-Gly-Phe),用此 15 个氨基酸序列对 NCBI的蛋白数据库进行BLAST检索，获得相似度高的16条木聚糖酶的蛋白质序列，将这些蛋白质序列通过软件DNAman进行AUGMENT比对，分析得到该类木聚糖酶的保守序列区(图2)，设计兼并引物Xyn-p I和Xyn-p2。PCR 扩增 以提取的基因组DNA为模板，使用Toyobo公司的高保真扩增酶KOD-plus，PCR扩增条件为94°C变性3分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，68 °C延伸I分钟，共10个循环；94°C变性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分钟，共20个循环；68°C延伸10分钟。得到ー个约450bp DNA片段。T-载体连接将上述PCR产物片段通过1%琼脂糖电泳，使用Omiga公司的胶回收试剂盒，并采用说明书提供的步骤回收PCR片段，随后将回收片段与T-载体pEASY-blunt simple (全式金公司)按说明书连接PCR产物和T载体，按《分子克隆》方法热激转化大肠杆菌DH5 α菌株。DNA序列測定将上述转化的后的阳性DH5a克隆接种于Iml LB培养基，交上海生エ生物技术公司进行DNA序列測定，使用通用测序引物M13+和M13-，测序获得如下序列GTGGTACTCGTTCTGGACCGACGCGCAGGGCACGGTCTCGATGACCCTGGGCTCCGGTGGCAACTACAGCACCAGCTGGCGCAACACCGGCAACTTCGTGGCCGGCAAGGGCTGGAGCACCGGCGCCCGCAGGAACGTGACCTACTCCGGCAGCTTCAACCCGTCCGGCAACGGCTACCTGTCGCTCTACGGCTGGACGTCGAACCCGCTCGTGGAGTACTACATCGTCGACAACTGGGGCACCTACCGGCCCACGGGGACGTACAAGGGCAGTGTCACCAGTGACGGCGGAACGTACGACATCTACCAGACGACGCGGTACAACGCCCCGTCCGTCGAGGGCACCAGGACCTTCAACCAGTACTGGAGCGTGCGGCAGTCGAAGCGCACCGGCGGCACCATCACCACCGGCAACCACTTCGACGCCTGGGTail-PCR引物的设计根据以上获得的DNA序列，在此序列内设计扩增木聚糖酶基因上游和下游Tail-PCR用引物各三条扩增方向为上游方向的引物分别命名为sp5-l，sp5_2和sp5_3，引物sp5-l在引物sp5-2外侧，引物sp5-2在引物sp5-3外测；引物扩增方向为下游方向的引物分别命名为sp3-l，sp3-2和sp3-3，引物sp3_l在引物sp3_2外侧，引物sp3_2在引物sp3-3外侧(表)。引物sp3-3和引物sp5-3之间存在200个bp的重叠区(图3)，保证Tail-PCR产物测序后，可以正确拼节出完整的基因序列。Tail-PCR Tail-PCR的方法參考刘耀光(文献)的方法；分别获得基因上游方向PCR片段为500bp (图4-1),下游方向为400bp (图4-2)。使的用扩增酶为Takara公司的ExTaq酶。T-载体连接将基因上游和下游扩增片段经过1%琼脂糖电泳后，由Omiga公司的胶回收试剂盒回收PCR片段，然后同T载体pEASY-simple Tl (全式金公司)连接，热激转化大肠杆菌DH5 α菌株。DNA序列测定将上述转化的后的阳性DH5A接种于Iml LB培养基，交上海生エ生物技术公司进行DNA序列測定，采用通用测序引物Μ13+和Μ13-。全长基因PCR扩增
根据测得基因上游和下游序列，由软件DNAmanO进行序列拼接，获得全长基因得DNA序列,根据获得序列，设计引物xynA-pl和xynA_p2,采用全基因组DNA为模板,高保真扩增酶KOD-plus，扩增条件为94°C变性3分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，68°C延伸I分钟，共10个循环；94°C变性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分钟，共20个循环；68°C延伸10分钟。得到单ー约1200bp DNA片段。T-载体连接将上述PCR产物片段通过I %琼脂糖电泳，采用Omiga公司的胶回收试剂盒并采用说明书提供的步骤回收PCR片段，随后将回收片段与T-载体pEASY-simple blunt (全式金公司)按说明书连接PCR产物和T载体，按《分子克隆》方法热激转化大肠杆菌DH5 α菌株。DNA序列测定将上述转化的后的阳性DH5a接种于1ml LB培养基，交上海生エ生物技术公司进行DNA序列測定，采用通用测序引物M13+和M13-。经DNAman分析得到ORF全长为671个碱基或者966个碱基的XylA全长蛋白质编码序列。通过对NCBI进行blast序列比对，序列分析为木聚糖酶，可能编码长为234氨基酸和322氨基酸两种多肽。pET28a(+)表达载体的构建根据基因序列可能编码长度不同的两种多肽，分别设计基因正向引物xynA-eLl和xynA-eSl以及反向引物xynA_eD2，采用全基因组DNA为模板，高保真扩增酶KOD-plus，扩增条件为94°C变性3分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，68°C延伸I分钟，共10个循环；94°C变性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分钟，共20个循环；68°C延伸10分钟。得到ー个680bp DNA片和段ー个985bp (图6) DNA片段。将上述PCR产物片段通过1%琼脂糖电泳，采用Omiga公司的胶回收试剂盒并采用说明书提供的步骤回收PCR片段，按实施例方法连接T载体，并按实施例进行序列測定，测定结果完全正确的克隆用于表达载体的构建。将正确T-载体菌株接种于5ml LB 37°C培基中陪养过夜，按Omiga试剂盒方法提取质粒，质粒经过EcoRI和XhoI酶切，经过OMIGA公司PCR纯化试剂盒纯化酶切产物，将纯化后产物于同样经过EcoRI和XhoI酶切并通过I %琼脂糖电泳,采用Omiga公司的胶回收试剂盒的回收载体骨架连接，连接体系为IOOngPCR产物酶切片段，IOng pET28a(+)产物片段，Ιμ Τ4连接酶缓冲液，Ιμ T4DNA连接酶，补充无菌超纯水至10 μ 1，连接条件为在16°C低温连接过夜，按《分子克隆》方法热激转化大肠杆菌DH5 α菌株。转化得到的阳性克隆用于培养及木聚糖酶表达。酵母表达载体的构建根据基因序列可能编码长度不同的两种多肽，分别设计基因正向引物xynA-yLl和xynA-ySl以及反向引物xynA_yD2,采用全基因组DNA为模板,高保真扩增酶KOD-plus,扩增条件为94°C变性3分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，68°C延伸I分钟，共15个循环；94°C变性30秒，54°C退火30秒，68°C延伸I分钟，共15个循环；68°C延伸10分钟。得到ー个680bp DNA片和段ー个985bp (图7) DNA片段。将上述PCR产物片段通过1%琼脂糖电泳，采用Omiga公司的胶回收试剂盒并采用说明书提供的步骤回收PCR片段，按实施例方法连接T载体，并按实施例进行序列測定，测定结果完全正确的克隆用于表达载体的构建。将正确T-载体菌株接种于5ml LB 37°C培基中陪养过夜，按OMGA试剂盒方法提取质粒，质粒经过EcoRI和AvrII酶切，经过Omiga公司PCR纯化试剂盒纯化酶切产物，将纯化后产物于同样经过EcoRI和AvrII酶切并通过I %琼脂糖电泳,采用Omiga公司的胶回收试剂盒的回收载体骨架连接，连接体系为IOOngPCR产物酶切片段，IOng pPIC9K产物片段，I μ I T4连接酶缓冲液，I μ I T4DNA连接酶，补充无菌超纯水至10 μ I，连接条件为在16°C低温连接过夜，按《分子克隆》方法热激转化大肠杆菌DH5 α菌株。毕赤酵母电激转化
将上述阳性克隆接种于500ml的LB培养基过夜，收集菌体后按Omiga公司质粒中型提取试剂盒提取质粒DNA，质粒DNA经过EcoRV酶切后，用Omiga公司胶回收试剂盒回收DNA片段，取至少2 μ g线性化的DNA电激转化毕赤酵母宿主菌GSl 15，RD培养基恢复培养。毕赤酵母产木聚糖酶转化子的筛选将RD培养基上正常生长的转化子转接于MD培养基中，待转化子纯化后，接种于3ml BMGY液体培养基富集培养36h，再转接入Iml BMMY液体培养基诱导培养24h，4°C，5000rpm,离心5min，得到上清液。将5 μ I上清液点于含O. 5%的桦木木聚糖底物的筛选培养基中，50°C反应30min，l%刚果红染色20min，lM NaCl脱色20min。有透明圈现象的为阳性转化子。木聚糖酶活性分析将上述阳性转化子接种于15ml BMGY液体培养基富集培养48h后，转接入50mlBMMY液体培养基诱导培养216h，每24h取样1ml，同时补加ImL终浓度O. 5%的诱导剂甲醇。4°C，5000rpm,离心5min处理发酵液样品，得到上清液，采用DNS法测定木聚糖酶活力。具体操作如下用O. 05M, pH值为5. 3的柠檬酸缓冲液稀释上清液样品，取100 μ I样品加入至900 μ I 1%的桦木木聚糖底物中，于55°C反应5min，加入Iml DNS反应终止液，于沸水中显色15min,加入Iml 40%的酒石酸钾钠溶液,于540nm下测定吸光度,计算得到木聚糖酶酶活。经上述木聚糖酶酶活力測定方法，得到6个高产酶转化子，分别为1-76、3-59、6-28、6-63、7-111、9-3，酶活力分别为 403±3U/mL、464±9U/mL、447± 13U/mL、479± IOU/mL、768±35U/mL、473±10U/mL。(图 5)木聚糖酶重组蛋白分析木聚糖酶基因XylA与载体pEASY-simple blunt连接转入大肠杆菌DH5 α中，发酵液经破壁后测定木聚糖酶活力为163U/mL，图6为其SDS-PAGE电泳图，由分析可知，木聚糖酶蛋白分子量为27KD。将木聚糖酶基因XylA与pPIC9K连接，诱导发酵196h。发酵液经浓度为12. 5%的SDS-PAGE变性凝胶电泳处理，电泳结束后，用考马斯亮蓝染色液染色20min，再用IM NaCl洗脱液脱色至蛋白带清晰，结果如图7所示，木聚糖酶蛋白大小为38kDa。
权利要求
1.一种木聚糖酶的核苷酸序列，其序列细节为SEQ NOl0
2.这个序列的至少90%的同源。
3.ー种木聚糖酶的多肽，其序列细节为SEQ N02。
4.这个序列的至少90%的同源。
5.ー种木聚糖酶的多肽，其序列细节为SEQ N03。
6.这个序列的至少90%的同源。
7.一种木聚糖酶的信号肽，其序列细节为SEQ N04。
8.这个序列的至少90%的同源。
9.包含权利1，2，3，4，5，6，7，8的重组载体。
10.权利9的大肠杆菌的重组表达系统。
11.权利9的毕赤酵母的重组表达系统。
12.类似于权利10，11在乳酸杆菌，酿酒酵母，芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)，曲霉(如黑曲霉或者米曲霉)中的表达应用。
13.权利1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12在造纸エ业，食品加工，饲料エ业，纺织エ业，生物能源，化妆品，医药保健品，以及各种生物反应器的应用。
全文摘要
本基因公开了一种来源于放线菌(Streptomyces rameus L2001)的木聚糖酶Xyn A的基因，包括其核酸和蛋白质/多肽序列。该基因编码的木聚糖酶Xyn A的最适反应pH值为5.3；50℃时pH值稳定范围是2.2～11.3，70℃时pH值稳定范围是4.3～6.7。该酶的最适反应温度为70℃；70℃时处理30min仍保留60％以上的酶活力。作为一种新的木聚糖酶，该酶及其作用产物具备在造纸工业，生物能源，食品加工，饲料工业，化妆品，医药，保健品，酿酒，农作物生产，以及各类生物反应器中的应用价值。
文档编号C12N15/81GK102643842SQ201210045108
公开日2012年8月22日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者孙学辉, 李秀婷, 李金春, 杨然, 滕超, 路铁刚 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 北京工商大学