本发明涉及一种培养基及其制备方法和应用，尤其涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
猪支原体肺炎又称猪地方性流行肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，我国俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病。主要临诊症状是咳嗽和气喘，常有其他病菌(如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等)继发感染。本病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场都有发生。猪只感染后通常会生长发育不良，生产性能显著下降，从而导致饲料转化率降低，药物治疗成本增加，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。由国内外临床经验可知，疫苗免疫是预防本病最重要的手段。
目前培养猪肺炎支原体的培养基主要有Friis培养基，KM2培养基，A26培养基及专利配方培养基(专利公布号：103060220A)。在以上所有培养基及培养方式上，仍然需要进一步降低血清的使用剂量，甚至无血清培养基的培养方式，同时提高疫苗抗原含量，才能达到目前的生产需求。
技术实现要素：
本发明所要解决的问题是提供一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用，用以降低培养猪肺炎支原体所需血清用量，提高猪肺炎支原体疫苗抗原效价。具体如下：
本发明的一方面，提供一种猪肺炎支原体培养基，其由基础培养基和辅助培养基经无菌处理后，用注射水定容制成，其中基础培养基和辅助培养基的组分分别为：
基础培养基：
辅助培养基：
如上所述的猪肺炎支原体培养基，每1000mL培养基中含有猪血清和鸡血清50-80mL，即整体培养基中血清添加的体积比例为5-8％。
本发明的另一方面，提供一种猪肺炎支原体培养基的制备方法，其包括下列步骤：
(1)制备基础培养基：取(1)-(8)成分配比逐一溶入200-400mL注射水中，在115℃灭菌20min，待冷却后备用；
(2)制备辅助培养基：取(9)-(14)成分过滤除菌，(15)和(16)成分经灭活、辐照处理，逐一溶入200-400mL灭菌的注射水中，即得辅助培养基；
(3)将基础培养基和辅助培养基混合，以灭菌注射水定容制成1000ml，用无菌1mol/L NaOH调节pH值7.6-7.8，分装备用。
本发明的再一方面，提供上述培养基在猪肺炎支原体疫苗抗原制备中的应用。
本发明所述猪肺炎支原体培养基具有以下特点：
(1)本发明培养基中血清含量低，降低了生产成本，同时减轻了血清对猪体的过敏应激反应，降低了猪肺炎支原体成品疫苗副反应发生率；
(2)应用本发明培养基制备疫苗抗原，猪肺炎支原体生长速度快，培养时间仅为2-3日，半成品菌液含菌量高达1.0×109-10CCU/mL，远高于行业标准要求，适合工业化大生产；
(3)应用本发明方法制备的猪肺炎支原体疫苗，抗原含量高，免疫效果好，免疫力坚强，能抵御猪肺炎支原体强毒的攻击。
具体实施方式
下面结合具体实施方式做进一步的说明，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本专利的保护范围。
实施例1配制猪肺炎支原体培养基
1、制备基础培养基：
1×汉克氏平衡盐缓冲液配制方法：NaCl 80.0g，CaCl21.4g，KCl 4g，MgCl2·6H2O 1.0g，KH2PO40.6g，MgSO4·7H2O 1.0g，Na2HPO4·12H2O 1.52g，酚红0.4g，加注射水至1000mL。
取上述的(1)-(8)成分配比逐一溶入300mL注射水中，115℃灭菌20min，待冷却后备用；
2、制备辅助培养基：
取(9)-(14)成分过滤除菌，(15)和(16)成分经灭活、辐照处理，逐一溶入300mL灭菌的注射水中，即得辅助培养基；
3、将基础培养基和辅助培养基混合，以灭菌注射水定容制成1000ml，用无菌1mol/L NaOH调节pH值7.8，分装备用。
实施例2配制猪肺炎支原体培养基
1、制备基础培养基：
取上述的(1)-(8)成分配比逐一溶入300mL注射水中，在115℃灭菌20min，待冷却后备用；
2、制备辅助培养基：
取(9)-(14)成分过滤除菌，(15)和(16)成分经灭活、辐照处理，逐一溶入300mL灭菌的注射水中，即得辅助培养基；
3、将基础培养基和辅助培养基混合，以灭菌注射水定容制成1000ml，用无菌1mol/L NaOH调节pH值7.8，分装备用。
实施例3应用猪肺炎支原体分别通过本发明培养基和不完全培养基(缺少部分成分)进行比较增殖培养：
1、制备培养基
将猪肺炎支原体J株(冻干菌种由瑞普(保定)生物药业有限公司生产部提供)分别接种于本发明的培养基1(同实施例1)及培养基2(根据实施例1要求进行配置，但未添加胃黏液素、精氨酸溶液、酪氨酸溶液、丝氨酸溶液、氯化胆碱及鸡血清)。
2、接菌培养
猪肺炎支原体J株种子继代复壮后，按照10％(V/V)分别接种，37℃培养，当培养基颜色变黄、pH值由7.8降至6.8时，取出培养物。
3、活菌滴度(CCU)测定
取6组无菌试管，每3组作为一种培养液的平行重复试验管，测定取13个10mL管制玻璃瓶，每瓶分装待检培养基1.8mL，接种0.2mL连续复壮后的菌种培养物至第一瓶，振荡混匀，吸取0.2mL再接种至第2瓶，依次做10倍系列稀释至第12瓶，第13瓶设未添加菌液的培养基为阴性对照。静置37℃培养，每日观察记录培养基颜色变化情况，第14日判定结果，如培养基对照管不变色，液体培养物按其稀释度依次有颜色变化，则试验成立。每组管制玻璃瓶中液体培养物变色的最高稀释度即为该培养物的CCU滴度，记录3组平行实验结果。
4、结果
由CCU测定可知，本发明制备的培养基1测得3个平行组的结果分别为109CCU/mL，109CCU/mL，1010CCU/mL，结果换算成4×109CCU/mL；而培养基2测得3个平行组的结果分别为107CCU/mL，107CCU/mL，108CCU/mL，结果换算成4×107CCU/mL。
未添加胃黏液素、精氨酸溶液、酪氨酸溶液、丝氨酸溶液、氯化胆碱及鸡血清的培养基2与已添加上述成份的培养基1，培养效果差异显著，差距约100倍，说明在本发明中的相关成份对猪肺炎支原体培养效果有一定作用。
实施例4配制猪肺炎支原体培养基
选择本发明支原体培养基(血清含量为5％)、A26培养基(血清含量为20％)及KM2培养基(血清含量为20％)对猪肺炎支原体J株进行比较增殖培养：
1、猪肺炎支原体菌液培养与制苗菌液制备：
将猪肺炎支原体(J株)生产用种子按10％(V/V)分别接种于以上3种培养基(200mL)中，37℃培养，pH值降低至6.7-6.8时收获；将上述传代后的菌液按10％(V/V)的量接种于以上3种培养基(2000mL)同样方法再次传代，直至收获菌液量扩大至200000mL，取适量上述半成品菌液进行活菌数测定，共测定3次。
2、活菌滴度(CCU)测定：
分别取以上3种培养基制备的猪肺炎支原体J株制苗菌液依次10倍系列稀释至第12管，再设培养基作阴性对照，置温度37℃恒温培养箱内培养，每日观察记录培养基颜色变化和混浊度变化，第14日判定结果，如培养基对照管不变色，则试验成立。最后发生颜色变化的稀释度即为该培养物的CCU滴度，3种菌液各测定3次，培养时间(培养周期)及含菌量的测定结果见表1：
表1猪肺炎支原体J株接种3种培养基制备制苗菌液的结果
3种培养基猪肺炎支原体培养时间差异明显：猪肺炎支原体J株在本发明制备的培养基中生长最快，为2-3日；KM2培养基生长时间为3-5日，A26培养基为4-5日。
3种培养基猪肺炎支原体半成品菌液的含菌量测定结果：本发明培养基、KM2培养基和A26培养基制备的制苗用菌液含菌量依次降低，且达到最终含菌量的时间依次延长，含菌量(和达到最终含菌量的测定时间)分别为4.0×109CCU/ml(10日)，1.0×108CCU/ml(13日)，7.0×107CCU/ml(14日)，说明本发明培养基制备猪肺炎支原体J株半成品菌液具有生长迅速，含菌量高的特点。
实施例5配制猪肺炎支原体培养基
用实施例3中应用本发明培养基培养的猪肺炎支原体(J株)半成品菌液制备猪肺炎支原体灭活疫苗，并进行疫苗的安全检验和效力检验。
1、猪肺炎支原体(J株)灭活疫苗制备
(1)灭活：在猪肺炎支原体菌液中加入质量浓度(m：V)37％的甲醛溶液灭活，甲醛溶液：猪肺炎支原体菌液＝1.5：1000(V：V)，37℃灭活24h，每1h摇匀一次。
(2)乳化：取水相5份加入到磁力搅拌罐中，在低速搅拌的同时，缓慢加入油相1份，以300r/min搅拌30分钟，即制得猪肺炎支原体(J株)灭活疫苗。
2、安全检验：取14日龄健康仔猪5头，颈部肌肉注射疫苗，连续观察14天并定期测定体温。结果表明，注射部位吸收良好，注苗仔猪无体温升高现象，饮食及精神状态无异常，安全检验合格。
3、效力检验：取30日龄仔猪10头，疫苗免疫后攻击强毒，根据肺部病变评分，按照标准免疫猪的肺部病变减少率应不低于60％；本次生产的疫苗免疫猪肺炎病变减少率平均高于80％，效力检验合格。