一种猪肺炎支原体菌株、疫苗及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及到一种新的猪肺炎支原体菌株以及利用这种菌株制作疫苗等多种用途。
背景技术：
：猪支原体肺炎又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体引起的一种猪的接触性慢性呼吸道疾病，呈世界普遍流行。据资料报道，世界各地分离的猪肺炎支原体均属于同一血清型，但分离株之间抗原性有很大差异。1992年Frey首次证实了猪肺炎支原体分离株之间抗原性的差异；1996年，Artiushin和Minion进一步证实了Frey的观点；1999年，Kokotovic也同样证实了这一结论。因此，分离出一株抗原性较好的猪肺炎支原体菌株进行疫苗和诊断试剂盒应用，对防治猪支原体肺炎至关重要，特别是分离出一株适合制备灭活疫苗的菌株，将填补国内无自主研发猪喘气病灭活疫苗的空白。猪肺炎支原体是猪支原体肺炎的病原体。猪支原体肺炎是猪的一种慢性消耗性呼吸道病，临床感染率极高。该疾病导致持续几周的持续性咳嗽、被毛失去光泽、生长迟缓和外观不壮实。猪群一旦感染猪肺炎支原体，便难以清除，不仅严重影响猪群的生长发育，用药量增加，而且容易继发感染PRRSV(猪蓝耳病病毒)、PCV(猪圆环病毒)等，从而导致多种疫苗接种失败。猪肺炎支原体作为猪呼吸道病综合征的重要病原之一，每年的经济损失估计在2亿～2.5亿美元之间。直接或间接对养猪业造成了巨大的经济损失。目前，世界上预防和控制猪肺炎支原体感染的有效的手段是对猪群进行疫苗免疫。大多数疫苗均为含有佐剂的全菌体灭活疫苗，通常情况下这些疫苗均能提供较好的保护作用，如改善临床症状，减少肺损伤，减少因猪肺炎支原体感染用药，提高生长效率等。目前，广泛应用的疫苗是以猪肺炎支原体J株或P株作为抗原的灭活疫苗，使用J株或P株制备的疫苗在全球很多国家销售和使用。然而，由于猪群中的流行株的变异，在临床上仍能观察到不同的猪群疫苗免疫后免疫效果方面存在差异，即存在一些免疫效果欠佳的群体。临床上观察到的这些差异原因是由于猪群中的流行株与疫苗株间存在抗原差异造成的(Villarreal等，BMCVeterinaryResearch2012，8:2)。有研究表明，目前猪群中流行的毒株在基因水平、蛋白水平以及毒力方面与疫苗使用的猪肺炎支原体J株或P株存在较大的差异(如文献Stakenborg等，VetMicrobiol2005，109:29-36；Calus等，VetMicrobiol2007，120:284-91.；Vicca等VetMicrobiol2003，97:177-190.；Meyns等，PrevVetMed2004，66:265-275中所报道的内容)。上述文献资料表明，疫苗使用的猪肺炎支原体J株对猪支原体肺炎的临床预防和治疗效果欠佳。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种新的猪肺炎支原体菌株，具有良好的免疫原性。为达上述目的，本发明的一个方案中提供了一种猪肺炎支原体菌株，菌株为猪肺炎支原体HP-G菌株MycoplasmahyopneumoniaeHP-Gstrain，该菌株的保藏编号为CCTCCNO：V2001661。上述猪肺炎支原体HP-G菌株的形态学描述如下：菌株接种琼脂平板，平板上形成细小圆形、边缘整齐、似露滴状、中间致密稍隆起的小菌落；培养物涂片，经过瑞氏染色可观察到具有特征性的多形态菌体，有点状、环状、球状和两极状。上述猪肺炎支原体HP-G菌株的基因序列如序列表SEQIDNO.1所示。基于本发明的猪肺炎支原体HP-G菌株，本发明还公开了该菌株的多种用途。本发明的猪肺炎支原体HP-G菌株在制备猪肺炎支原体疫苗中的应用。猪肺炎支原体HP-G菌株在制备免疫诊断用试剂盒中的应用。猪肺炎支原体HP-G菌株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用。效力检验的应用包括将猪肺炎支原体HP-G菌株的培养物进行攻毒的步骤。猪肺炎支原体HP-G菌株在制备猪肺炎支原体抗体或高免血清中的应用。本发明的另一个目的是利用猪肺炎支原体HP-G菌株制备成疫苗。对此，本发明的另一个方案是公开一种猪肺炎支原体疫苗，包括将猪肺炎支原体HP-G菌株处理制备成的抗原疫苗，并且在优化的方案中，疫苗中还包括佐剂；佐剂可以选择现有技术中任意一种或者多种试剂的组合物，佐剂的功能主要包括：增强疫苗抗原的免疫原性；促进细胞免疫和体液免疫，优化免疫应答，促进免疫能力较弱人群中的免疫应答；增进抗原与黏膜之间的传递以及免疫接触；减少疫苗成分中抗原的需求量以及在实施过程中的免疫接种次数；优化抗原结构，维持抗原构象等。佐剂的种类丰富，根据其功能，可分为运载传递系统和免疫刺激性佐剂。佐剂包括运载体即能与半抗原结合的一类具有免疫原性质的物质，还包括对整个疫苗系统起运输传递和衬托作用的一类物质。根据佐剂的来源，佐剂可以为为细菌性、非细菌性、微生物性、细胞因子类以及合成体类等。根据理化性质，佐剂可以为颗粒性、凝胶性、乳胶佐剂等。跟据其性能，佐剂可以为治疗性佐剂、免疫刺激性佐剂、黏膜佐剂以及基因佐剂等。此外，本发明还公开了一种制备猪肺炎支原体疫苗的方法，包括将猪肺炎支原体HP-G菌株灭活处理的步骤。综上所述，本发明具有以下优点：本发明的猪肺炎支原体HP-G菌株经过测序和同源性分析，与已知的疫苗菌株同源性高达98.4％以上，相比现有的菌株具有更显著的免疫原性，能够使肺炎病变减少率显著提高，增强猪自身的免疫能力，减少发病率。附图说明图1为本发明一个实施例HP-G株PCR鉴定扩增结果；其中，1为MakerIII；2代表培养传代培养物；3代表攻毒后再分离培养的培养物；4代表J株。图2为本发明一个实施例同源性分析结果图。具体实施方式1材料1.1、发病猪病料：在全国各地采集临床症状与猪喘气病相似，疑似为猪支原体肺炎感染的病猪，无菌采取具有典型的猪支原体肺炎病变的肺脏15个。1.2、菌株来源标准对照菌株：猪肺炎支原体济南系强毒株CVCC354，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和供应。实验株：猪肺炎支原体HP-G菌株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2016年12月6日，保藏号为CCTCCNO：V2001661。1.3、培养基：改良A26培养基由四川省华派生物制药有限公司配制，培养基的处方以及配置方法如下：培养基制备方法：将上述成份混匀，于121℃，20分钟高压灭菌；待培养基温度下降到37℃时，加入20％无特异性抗体猪血清(56℃灭活30分钟)160ml，青霉素(250单位/ml)20万，用NaOH调pH值至7.5～7.6。1.4、主要试剂：2×TaqPCRMasterMix、MakerIII，购自TIANGEN生物科技公司；猪肺炎支原体间接血凝检测试剂，由四川省华派生物制药有限公司制造；乳化剂28VG，购自seppic公司。猪肺炎支原体间接血凝检测试剂：冻干的10％抗原致敏红细胞，使用时用1/15mol/LPBS(pH值7.2)稀释至2％抗原致敏红细胞，供作IHA检验用。1.5、试验猪：14～21日龄健康易感猪，由四川省华派生物制药有限公司定点猪场提供，经猪肺炎支原体间接血凝检测猪肺炎支原体抗体为阴性(≤1:4)。1.6间接血凝的材料冻干的10％抗原致敏红细胞，使用时用1/15mol/LPBS(pH值7.2)稀释至2％抗原致敏红细胞，供作IHA检验用。阳性、阴性对照血清，2～8℃或冻结保存。微量反应板：为96孔V型有机玻璃板或塑料板。稀释剂：含1％健康兔血清(56℃，30分钟灭活)的1/15mol/LPBS(pH值7.2)。1.7操作方法1.71待检血清的处理：待检血清经56℃灭活30分钟。1.72加PBS稀释剂：反应板每一孔中各加稀释剂25μl。1.73稀释血清：在第一列孔分别加待检血清、阳性、阴性血清各25μl，然后倍比稀释至第6孔，最后弃去25μl。1.74加抗原致敏红细胞：每孔加2％抗原致敏红细胞25μl；抗原对照25μl稀释剂+25μl抗原致敏红细胞。1.75反应：加样完毕，置微型振荡器上振荡15秒左右，室温下静置1～2小时判定结果。1.76判定：当阳性血清效价≥1:64，阴性血清效价≤1:4，抗原致敏红细胞对照孔无自凝时试验成立。以呈现(++)血凝反应的血清最高稀释度作为血清效价终点。当待检血清效价≥1:16时，判为阳性；血清效价≤1:8时，判为阴性。1.77判定标准：以呈现(++)血凝反应的血清最高稀释度作为血清效价终点。2实验株的分离：2.1、病料的处理使用无菌手术剪取试验猪发病部位的边缘组织，将边缘组织剪碎成芝麻粒大小，然后分别浸泡入15管改良A26培养基中，37℃培养，培养基颜色变黄时传代，再进行病料分离鉴定。2.2、病料的分离鉴定2.2.1培养特性的观察：将2.1中培养的15管菌液，分别传代至A26液体培养基和A26琼脂平板，对各分离菌在两种培养状态下的培养特性进行观察。2.2.2染色镜检：取培养物进行涂片，用革兰氏染色液和瑞氏染色液进行染色观察。本发明的菌株在接种琼脂平板后，能够在平板上形成细小圆形、边缘整齐、似露滴状、中间致密稍隆起的小菌落；培养物涂片，经过瑞氏染色可观察到具有特征性的多形态菌体，有点状、环状、球状和两极状。因此，在培养过程中具有上述形态的菌落为本发明的猪肺炎支原体HP-G菌株。2.3猪肺炎支原体纯化菌株的鉴定将2.2中已选定的流行性猪肺炎支原体菌株，进一步鉴定验证，方法如下：2.3.1PCR鉴定根据Genbank中公布的猪肺炎支原体P36基因组序列设计一对特异性引物，并提交给Invitrogen合成，引物序列为：P1：5-TTACAGCGGGAAGACC-3’，P1：5’-CGGCGAGAAACTGGATA-3’。将选出经培养传代试验和染色镜检试验鉴定为猪肺炎支原体的培养物按文献方法提取基因组DNA，进行PCR扩增，扩增结束后取上述产物5ul在在1％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，检测结果如图1所示。PCR鉴定结果：将初步证明为肺炎支原体的菌株进行PCR扩增，结果与猪肺炎支原体J株PCR的扩增结果大小一致，并与预期片段427bp大小一致的菌株为肺炎支原体。2.3.2血清学鉴定2.3.2.1代谢抑制试验取不含血清的A26培养基，按20％比例加入兔抗猪肺炎支原体J株高免血清，按1:5培养基容量接种分离菌株培养物，分装5支试管，2ml/支，同时设立加入20％健康兔血清和猪支原体肺炎阴性健康猪血清的A26培养基作为对照，分装5支试管，37℃培养13d，进行代谢抑制试验，观察培养基颜色变化情况，鉴定分离菌株是否为猪肺炎支原体。代谢抑制试验结果：将经过PCR鉴定的肺炎支原体的培养物加入兔抗猪肺炎支原体J株高免血清的培养液，37℃培养13d，能观察到悬浮细小颗粒，油镜检查有少量具有支原体特征的菌体，培养液颜色和pH值均无变化。而经过PCR鉴定的肺炎支原体的分离菌培养物加入20％健康兔血清和猪支原体肺炎阴性健康猪血清的A26培养基，观察到培养液颜色由红色变为黄色，pH值由7.6～7.5下降到7.0以下，镜检有大量支原体菌体存在。2.3.2.2生长抑制试验用新制备的厚度不少于4mm的A26琼脂平板3块，使其挥发去多余水分。将对数期的支原体肉汤培养物稀释100～1000倍，其浓度大约为1.0×106CCU/mL，取100μL接种于琼脂平板上，涂布均匀，放置片刻。用灭菌镊子将预先准备好的抗血清滤纸片(直径6mm，无菌滤纸片已吸附1滴抗猪肺炎支原体J株血清，干燥)贴附于接种后的平板上，纸片间距1.5～2.0cm，每块平板放置3张抗血清的试验纸片，另设1张无血清空白纸片对照，培养7～10d。在低倍镜下，测量抗血清纸片的抑菌圈直径。判定标准为：直径大于1.0mm为阳性；小于0.5mm为阴性；介于二者之间时，可降低培养基中血清或酵母浸液浓度重复1次。生长抑制试验结果：3组分离菌分别培养的A26的琼脂平板上，各抗猪肺炎支原体J株血清纸片周围，均可明显观察到抑菌圈，抑菌圈直径2.3mm～2.8mm之间，而对照纸片周围不能观察到抑菌圈，结果见下表1。表1：3组分离菌株各生长抑制圈大小实验菌株第一组第二组第三组对照纸片纸片1(mm)2.32.62.60纸片2(mm)2.22.52.60纸片3(mm)2.52.82.70抑菌圈直径(mm)2.32.62.602.3.3分离菌株毒力检测试验组组数由分离菌株鉴定出的猪肺炎支原体株数数定，A26培养基为对照组。每组5头猪，试验组胸腔注射3ml，气管注射2ml，共5ml的菌液稀释液(1×107CCU/ml)，对照组以同样的方式胸腔3ml、气管2ml，共5ml的A26培养基，攻毒后隔离饲养，连续观察25～30日后，对所有试验猪进行剖杀，观察肺部病理变化，参照Goodwin55分计分法对各试验猪的肺部喘气病病变进行评分。选3株分离毒株分别进行毒力试验，将健康易感猪20头，分为4组，每组5头，其中对照组注射A26培养基，攻毒试验组3组，分别注射3组(第一组、第二组、第三组)分离株的新鲜培养物，攻毒试验猪攻毒后出现食欲不振，精神不佳，10～16日内出现咳嗽、喘气等临床症状，个别攻毒试验猪有发热的现象，而对照组猪均未表现出任何不良反应。攻毒后25～30日剖检攻毒猪，可见肺脏的尖叶、心叶、中间叶或膈叶前缘有不同程度的特征性的支原体肺炎病变，呈“胰样变”或“肉样变”，对各试验猪肺部病变按Goodwin55分计分法计分，病变评分见表2。从表2可以看出，3组攻毒猪均出现不同程度的肺部病变，与对照组肺部病变差异显著，说明本发明的菌株毒力较好且相当。表2试验猪肺炎病变评分2.3.4攻毒猪病变肺中支原体的再分离同2.1的方法从攻毒猪病变肺中进行猪肺炎支原体的再分离和鉴定。结果：将攻毒病变猪肺按2.1的方法再分离。传代培养后显示pH值下降；涂片染色镜检具有特征性的多形态菌体，有点状、环状、球状和两极状，无杂菌污染；PCR扩增，结果与猪肺炎支原体J株PCR的扩增结果大小一致，并与攻毒前片段427bp大小一致。2.3.5各分离菌株免疫原性测定将分离鉴定出的菌株纯培养物进行灭活乳化配制。每株分别取14～21日龄健康易感猪(猪肺炎支原体血清抗体阴性)，每个分离菌株免疫5头，各颈部肌肉注射疫苗1.0ml，接种后14日按相同剂量和方式加强接种1次，另外5头不接种作为对照，同条件下饲养。首次接种后55～60日，连同对照组5头，各气管注射100MID的猪肺炎支原体济南系强毒CVCC354冻干肺组织毒，观察25～30日，剖杀全部试验猪。按Goodwin55分计分法对各试验猪的肺炎病变进行评分，并计算肺部病变平均分及肺部病变减少率。实验过程和结果：将免疫组试验猪分为3组，每组5头，分别免疫由3株(J株、AV747株、HP-G)分离菌株分别配制的疫苗，按2.3.5方法免疫，免疫注射后，未发现试验猪有任何不良反应，采食和精神状态均良好，首免55～60日后对所有试验猪进行攻毒，连续观察25～30日，发现对照组试验猪攻毒后出现食欲不振，精神不佳，7～14日内出现咳嗽、喘气等临床症状，免疫组中AV747株试验组有3头猪出现咳嗽等呼吸道症状，只有2/5保护，而J株试验组有2头猪出现咳嗽等呼吸道症状，呈3/5保护，HP-G试验组所有免疫猪未见任何不良反应，采食和精神状态均良好，5/5保护。攻毒28日后，对所有猪进行剖杀，观察肺部病变，按Goodwin55分计分法对肺部病变计分，并计算肺炎病变减少率，结果见表3。从表3中可以看出免疫AV747株的试验组中，试验猪肺部病变最严重，其次为J株，而HP-G株试验猪肺部病变几乎不明显，其病变较少率更是高达84.2％，具有很好的免疫原性。表3试验猪肺炎病变减少情况通过以上试验得知，我们从15株全国疑似猪肺炎支原体的病料中，最终分离鉴定出HP-G株猪肺炎支原体菌株，HP-G株的免疫原性都较现有技术中其他两株好，所以可以选定HP-G为支原体肺炎疫苗研制的疫苗株。2.4疫苗株序列分析通过2.3试验，将HP-G株做为疫苗株，将该疫苗株的培养物进行PCR扩增，产物进行测序，并与GenBank中的4个国际主要代表疫苗株相应的序列进行序列分析和同源性分析。用于比较的参考毒株名称及其在GenBank中的登陆号为：J(NCO07295)、168(NC017509)、232(NC006360)、7448(NC007332)。将基本选定支原体肺炎疫苗研制疫苗株的HP-G进行PCR扩增，扩增结果见图1，并送Invitrogen公司测序，测序结果经NCBI-Blast和DNAStar比对分析，猪肺炎支原体HP-G菌株的基因序列如序列表SEQIDNO.1所示。HP-G的序列分别J株、168株、232株、7448株相比，个别碱基有差别，与J株序列(基因号：NC007295)比对发现在第8个碱基出多一个G碱基，第134、224、341个碱基处不一致；与168株序列(基因号：NC017509)反向互补，并在第8个碱基出多一个G碱基，第134、224、341、382个碱基处不一致；与232株序列(基因号：NC006360)，并在第8个碱基出多一个G碱基，在第27、134、171、224、341、350个碱基处不一致；与7448株序列(基因号：NC007332)比对，在第8个碱基出多一个G碱基，在第134、224、341、381个碱基处不一致。2.5同源性分析将本发明的支原体肺炎疫苗研制疫苗株的HP-G与NCBI基因库选出4株国内外参考菌株的基因进行同源性比对，比对结果如图2。测序结果经NCBI-Blast和DNAStar比对分析，目的序列与J株序列(基因号：NC007295)同源性为99.1％；与168株序列(基因号：NC017509)的同源性为98.8％；与232株序列(基因号：NC006360)的同源性为98.4％；与7448株序列(基因号：NC007332)的同源性为98.8％。序列分析及同源性分析结果表明，基本选定的HP-G株与国内外支原体肺炎参考疫苗株同源性在99％以上，故可以将选定的HP-G作为支原体肺炎疫苗研制的疫苗株。本发明还公开了将HP-G菌株用于制备成抗原疫苗以及该疫苗的制备方法，疫苗的制备方法中包括了将HP-G株灭活的步骤，也包括添加佐剂的步骤。此外，本发明得疫苗灭活方法和疫苗的制备方法可以选择现有技术中任意一种方法，也可选择任意一种其他方法。基于本发明的猪肺炎支原体HP-G菌株，本发明还公开了该菌株的多种用途。例如本发明的猪肺炎支原体HP-G菌株在制备猪肺炎支原体疫苗中的应用；猪肺炎支原体HP-G菌株在制备免疫诊断用试剂盒中的应用；猪肺炎支原体HP-G菌株在猪肺炎支原体疫苗效力检验中的应用；效力检验的应用包括将猪肺炎支原体HP-G菌株的培养物进行攻毒的步骤；猪肺炎支原体HP-G菌株在制备猪肺炎支原体抗体或高免血清中的应用。这些应用不局限于本发明所指的具体形式，这些应用的具体实施方式可以采用现有的任意一种使用、检验或者鉴定、制备方式。SEQUENCELISTING<110>四川省华派生物制药有限公司<120>一种猪肺炎支原体菌株、疫苗及其应用<130>无<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>428<212>DNA<213>猪肺炎支原体（M.hyopneumoniae）<400>1ttacagcggggaagaccacaaaaaccgggtgaaactcggcttgaattagtagctgataac60atccgaattatccgggaaattgcactaaaagtcaaagaaagtggctttagtggaataagt120attattgttgctagtcctgttgatataattacaagggcttaccgggatgcatctggattt180tccgatcaaaaagttatcggtagtggaactgttttagatacagtaaggcttcaatttgca240atcgcaaaaagagcaaaagtatcgcctaattcggttcaggcctacgtgatgggtgaacat300ggtgattcatcttttgttgcttattcaaatattaaaattggcggtgaatgtttctgtgct360tattctaaactaaccggaattgatagctcaaattacgaaaaagaacttgaatatccagtt420tctcgccg428当前第1页1 2 3