一株发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌的制作方法

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一株利用葡萄糖或木糖发酵直接生产L-天冬氨酸的基因工程菌。

背景技术：

L-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，L-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。具有良好的市场前景。

目前L-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，而目前富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，L-天冬氨酸的制备仍然依赖化石资源。葡萄糖、木糖等单糖可来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够直接通过发酵制备L-天冬氨酸的生产菌株具有重要的意义。先期也获得了一株厌氧条件下能够利用单糖发酵制备L-天冬氨酸的菌株（CN105296411A），但厌氧环境下菌株生长稳定性偏差，且产物浓度仅10 g/L，因此进一步构建筛选获得了一株在有氧条件下生长性能优良且浓度更高的菌株。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一株通过发酵生产L-天冬氨酸的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建及选育的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli)CM-AS-115，其保藏号为CCTCC NO：M 2016457。

上述基因工程菌的构建及选育的方法如下：将出发菌株的多个基因失活：包括异柠檬酸脱氢酶编码基因（icdA），苹果酸脱氢酶编码基因（mdh），苹果酸酶编码基因（sfcA和maeB）和有氧条件下起作用的富马酸酶编码基因（fumAC），获得菌株CM-AS-100。

对上述菌株CM-AS-100实施进化代谢驯化，获得突变株CM-AS-105。

将突变株CM-AS-105的两个基因超量表达：包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因（ppc）和天冬氨酸酶编码基因（aspA），获得大肠杆菌（Escherichia coli) CM-AS-115。

所述出发菌株为野生型大肠杆菌W1485（ATCC12435），将出发菌株敲除多个基因获得重组菌株CM-AS-100，涉及的基因在大肠杆菌信息学数据库Ecogene（http://www.ecogene.org）中的编号分别为：icdA（EG10489），mdh（EG10576），sfcA（EG10948），maeB（EG14193），fumAC（EG10356和EG10358），基因敲除采用的方法为RED重组。

利用同源重组技术敲除原始大肠杆菌W1485（ATCC12435）中柠檬酸脱氢酶编码基因（icdA），苹果酸脱氢酶编码基因（mdh），苹果酸酶编码基因（sfcA和maeB）和有氧条件下起作用的富马酸酶编码基因（fumAC）五个基因，其敲除过程基本一致，以fumAC基因的敲除为例，具体步骤包括：

1、利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌W1485至OD600=0.4～0.6，制备成电转感受态。

2、将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌W1485。电击条件为：200 Ω，25 μF，电击电压2.3 kv，电击时间4～5 ms。电击后迅速将菌体加入预冷1 mL的SOC培养基，150r/min、30℃培养1 h之后涂布于带氨苄青霉素（amp）的 LB培养基平板筛选出阳性转化子W1485 (pKD46)。

3、在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态。

4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有FUM同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下：

上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段：

5’-CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTCCG GGGATCCGTCGACC-3’

下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段:

5’-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAA TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

反应体系：带同源臂的上下游引物（100 pmol/μl）各0.5 μl；模板DNA（100 ng/μl）0.5μl；10×buffer 5μl；dNTPs（10 mM）各1 μl；DMSO（100%）2.5μl；Pyrobest DNA聚合酶（2.5 U/μl）1μl；ddH2O 36/35.5μl；总体积50μl。

反应条件：94℃，2 min；（94℃，45 sec；50℃，45 sec；72℃，90 sec；10 个循环）；（94℃，45 sec；55℃，45 sec；72℃，90 sec；15个循环）；72℃，5 min。

5、电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌W1485感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定。

6、阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株。

所述菌株CM-AS-100在有氧条件下生长缓慢，采用超过50轮的进化代谢驯化后，筛选获得了具有稳定遗传的突变株CM-AS-105。进化代谢是菌体本身对环境的适应过程，当某一种微生物在连续培养时发生变异，则突变菌株与原始菌株发生竞争，如果突变的菌株较原始菌株具有优势，则突变菌株在反应器中得到保留。

具体的，突变株CM-AS-105采用质粒共表达的方式超量表达两个酶，分别为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和天冬氨酸酶，其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因（ppc）的核苷酸序列在大肠杆菌信息学数据库Ecogene中的编号为EG10756；天冬氨酸酶编码基因（aspA）的编号为EG10095。所述的质粒为pTrc99a，两个基因各自有自身的操纵子。具体方法如下：

1、构建超量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因（ppc）和天冬氨酸酶编码基因（aspA）的表达质粒，其过程包括：

（1）人工设计并合成两端带有Nco I和Hind III酶切位点，内含两个基因的操纵子，具体序列见SEQ ID NO：1。

（2）表达质粒pTrc99a分别用Nco I和Hind III双酶切，并与合成的基因连接获得重组质粒pTrc99a-ppc-aspA。

2、将质粒pTrc99a-ppc-aspA导入突变株CM-AS-105感受态，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株大肠杆菌（Escherichia coli) CM-AS-115。将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016457。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的应用，具体为所述基因工程菌在发酵制备L-天冬氨酸中的应用。

其中，种子液培养过程如下：

(S1) 按体积分数为1~2%从冻存管转接到LB培养基中，有氧培养10～12h；

(S2) 按体积分数为1~2%转接到种子发酵罐的LB培养基中；

(S3) 待菌体OD₆₀₀至2.5~4时，按体积比为5~10%接种发酵培养基，所述发酵培养基的配方为：JSG培养基，柠檬酸 3.0 g/L；Na₂HPO₄∙7H₂O 3.00 g/L；KH₂PO₄ 8.00 g/L；(NH₄)₂HPO₄20.00 g/L；NH₄Cl 10 g/L；(NH₄)₂SO₄ 5 g/L；MgSO₄∙7H₂O 1.00 g/L；CaCl₂∙2H₂O 10.0 mg/L；ZnSO₄∙7H₂O 0.5 mg/L；CuCl₂∙2H₂O 0.25 mg/L；MnSO₄∙H₂O 2.5 mg/L；CoCl₂∙6H₂O 1.75 mg/L；H₃BO₃ 0.12 mg/L；Al₂(SO₄ )₃∙xH₂O 1.77 mg/L；Na₂MoO₄∙2H₂O 0.5 mg/L；Fe(III) citrate 16.1 mg/L，溶剂为水，灭菌后用氨水调节pH为8.0，其中葡萄糖单独灭菌后分为3次加入。

步骤(S1)和(S2)中，培养温度控制在35~37℃，步骤(S3)的温度控制在30~32℃

其特征在于步骤(S3)中溶解氧控制在5~40%，且培养过程pH用氨水调节为7.8～8.8。

有益效果：本发明创新性地替代了原有L-天冬氨酸采用酶转化的方法，彻底摆脱了依赖于石油基富马酸的问题，实现了完全采用可再生生物质资源（如葡萄糖、木糖等）为原料发酵制备L-天冬氨酸的路线，该路线绿色、环保。

附图说明

图1 线性DNA片段的鉴定。

图2 菌落PCR鉴定图。

图3 .进化代谢连续培养过程。

本发明所述的生物材料，其分类命名为大肠杆菌（Escherichia coli) CM-AS-115，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M 2016457，保藏日期为：2016年9月5日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

本实施例说明利用同源重组技术敲除原始大肠杆菌W1485（ATCC12435）中柠檬酸脱氢酶编码基因（icdA），苹果酸脱氢酶编码基因（mdh），苹果酸酶编码基因（sfcA和maeB）和有氧条件下起作用的富马酸酶编码基因（fumAC）五个基因，其敲除过程基本一致，以fumAC基因的敲除为例，具体步骤包括：

1、利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌W1485至OD600=0.4～0.6，制备成电转感受态。

2、将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌W1485。电击条件为：200 Ω，25 μF，电击电压2.3 kv，电击时间4～5 ms。电击后迅速将菌体加入预冷1 mL的SOC培养基，150r/min、30℃培养1 h之后涂布于带氨苄青霉素（amp）的 LB培养基平板筛选出阳性转化子W1485 (pKD46)。

3、在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态。

4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有FUM同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下：

上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段：

5’-CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTCCG GGGATCCGTCGACC-3’

下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段:

5’-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAA TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

反应体系：带同源臂的上下游引物（100 pmol/μl）各0.5 μl；模板DNA（100 ng/μl）0.5μl；10×buffer 5μl；dNTPs（10 mM）各1 μl；DMSO（100%）2.5μl；Pyrobest DNA聚合酶（2.5 U/μl）1μl；ddH2O 36/35.5μl；总体积50μl。

反应条件：94℃，2 min；（94℃，45 sec；50℃，45 sec；72℃，90 sec；10 个循环）；（94℃，45 sec；55℃，45 sec；72℃，90 sec；15个循环）；72℃，5 min。

线性DNA片段的鉴定如图1。

5、电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌W1485感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定，电泳图如图2所示。

6、阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌即为已经敲除抗性的菌株。

实施例2

本实施例说明通过进化代谢选育获得在有氧条件下细胞生长性能良好的突变菌株。

进化代谢是菌体本身对环境的适应过程，当某一种微生物在连续培养时发生变异，则突变菌株与原始菌株发生竞争，如果突变的菌株较原始菌株具有优势，则突变菌株在反应器中得到保留。

如图3所示，连续培养的开始阶段以0.015 h^-1的稀释速率不断的流加含有葡萄糖的新鲜培养基，进化代谢装置内的初始菌株的密度为0.6，随着菌株对环境的不断适应，菌体的浓度在不断的上升，当反应器中的菌体密度达到稳定并保持一段时间不再变化时，提高稀释速率为0.03 h^-1，此时反应器中菌体浓度迅速下降，这表明菌体生长速度变慢，大量菌体被洗出反应器，从而造成菌体密度下降，对于生长缓慢，不能迅速适应新的环境的菌体，则迅速被优势的菌体淘汰。在此情况下随着适应环境的菌体慢慢生长，菌体密度将缓慢上升，最终反应器中的菌体密度达到稳定，并保持3个保留体积不变，从而使其在0.03 h^-1的稀释条件下可以稳定生长。此时，继续提高培养基的流加速率，在0.06 h^-1的稀释速率条件下，反应器中菌体密度的变化趋势都是先下降，然后缓慢上升，并最终保持稳定。

实施例3

本实施例说明构建超量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因（ppc）和天冬氨酸酶编码基因（aspA）的表达质粒，并将重组质粒导入突变株CM-AS-105中，提高菌株L-天冬氨酸的浓度和收率。

1、构建超量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因（ppc）和天冬氨酸酶编码基因（aspA）的表达质粒，其过程包括：

（1）人工设计并合成两端带有Nco I和Hind III酶切位点，内含两个基因的操纵子，具体序列见SEQ ID NO：1。

（2）表达质粒pTrc99a分别用Nco I和Hind III双酶切，并与合成的基因连接获得重组质粒pTrc99a-ppc-aspA。

2、将质粒pTrc99a-ppc-aspA导入突变株CM-AS-105感受态，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株大肠杆菌（Escherichia coli) CM-AS-115。将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016457。

实施例4

本实施例说明新构建的重组大肠杆菌（Escherichia coli) CM-AS-115发酵产L-天冬氨酸的能力。

1、采用LB培养基按1～2%（v/v）接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2%（v/v）接种量接种至种子发酵罐（培养基也为LB），培养4～6h后待菌体OD₆₀₀至2.5～4之间，按5～10%接种发酵培养基（JSG培养基，葡萄糖为碳源分批补加）；

2、种子培养过程温度控制在35～37℃，培养中不需调节pH。发酵过程采用有氧发酵模式，发酵过程温度控制在30～32℃，培养过程pH用氨水控制在7.8～8.8，溶氧控制在5～40%。

CM-AS-115发酵结果见表1。由表1可见，大肠杆菌（Escherichia coli) CM-AS-115具有良好的生产L-天冬氨酸的能力，将该菌用于生物发酵制备L-天冬氨酸具有重大的潜力。

表1 大肠杆菌（Escherichia coli) CM-AS-115发酵产酸情况

序列表

<110> 常茂生物化学工程股份有限公司

<120> 一株发酵产L-天冬氨酸的基因工程菌

<160> xb16102602

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4371

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccatggttat aaaagacgac gaaaagcaaa gcccgagcat attcgcgcca atgcgacgtg 60

aaggatacag ggctatcaaa cgataagatg gggtgtctgg ggtaatatga acgaacaata 120

ttccgcattg cgtagtaatg tcagtatgct cggcaaagtg ctgggagaaa ccatcaagga 180

tgcgttggga gaacacattc ttgaacgcgt agaaactatc cgtaagttgt cgaaatcttc 240

acgcgctggc aatgatgcta accgccagga gttgctcacc accttacaaa atttgtcgaa 300

cgacgagctg ctgcccgttg cgcgtgcgtt tagtcagttc ctgaacctgg ccaacaccgc 360

cgagcaatac cacagcattt cgccgaaagg cgaagctgcc agcaacccgg aagtgatcgc 420

ccgcaccctg cgtaaactga aaaaccagcc ggaactgagc gaagacacca tcaaaaaagc 480

agtggaatcg ctgtcgctgg aactggtcct cacggctcac ccaaccgaaa ttacccgtcg 540

tacactgatc cacaaaatgg tggaagtgaa cgcctgttta aaacagctcg ataacaaaga 600

tatcgctgac tacgaacaca accagctgat gcgtcgcctg cgccagttga tcgcccagtc 660

atggcatacc gatgaaatcc gtaagctgcg tccaagcccg gtagatgaag ccaaatgggg 720

ctttgccgta gtggaaaaca gcctgtggca aggcgtacca aattacctgc gcgaactgaa 780

cgaacaactg gaagagaacc tcggctacaa actgcccgtc gaatttgttc cggtccgttt 840

tacttcgtgg atgggcggcg accgcgacgg caacccgaac gtcactgccg atatcacccg 900

ccacgtcctg ctactcagcc gctggaaagc caccgatttg ttcctgaaag atattcaggt 960

gctggtttct gaactgtcga tggttgaagc gacccctgaa ctgctggcgc tggttggcga 1020

agaaggtgcc gcagaaccgt atcgctatct gatgaaaaac ctgcgttctc gcctgatggc 1080

gacacaggca tggctggaag cgcgcctgaa aggcgaagaa ctgccaaaac cagaaggcct 1140

gctgacacaa aacgaagaac tgtgggaacc gctctacgct tgctaccagt cacttcaggc 1200

gtgtggcatg ggtattatcg ccaacggcga tctgctcgac accctgcgcc gcgtgaaatg 1260

tttcggcgta ccgctggtcc gtattgatat ccgtcaggag agcacgcgtc ataccgaagc 1320

gctgggcgag ctgacccgct acctcggtat cggcgactac gaaagctggt cagaggccga 1380

caaacaggcg ttcctgatcc gcgaactgaa ctccaaacgt ccgcttctgc cgcgcaactg 1440

gcaaccaagc gccgaaacgc gcgaagtgct cgatacctgc caggtgattg ccgaagcacc 1500

gcaaggctcc attgccgcct acgtgatctc gatggcgaaa acgccgtccg acgtactggc 1560

tgtccacctg ctgctgaaag aagcgggtat cgggtttgcg atgccggttg ctccgctgtt 1620

tgaaaccctc gatgatctga acaacgccaa cgatgtcatg acccagctgc tcaatattga 1680

ctggtatcgt ggcctgattc agggcaaaca gatggtgatg attggctatt ccgactcagc 1740

aaaagatgcg ggagtgatgg cagcttcctg ggcgcaatat caggcacagg atgcattaat 1800

caaaacctgc gaaaaagcgg gtattgagct gacgttgttc cacggtcgcg gcggttccat 1860

tggtcgcggc ggcgcacctg ctcatgcggc gctgctgtca caaccgccag gaagcctgaa 1920

aggcggcctg cgcgtaaccg aacagggcga gatgatccgc tttaaatatg gtctgccaga 1980

aatcaccgtc agcagcctgt cgctttatac cggggcgatt ctggaagcca acctgctgcc 2040

accgccggag ccgaaagaga gctggcgtcg cattatggat gaactgtcag tcatctcctg 2100

cgatgtctac cgcggctacg tacgtgaaaa caaagatttt gtgccttact tccgctccgc 2160

tacgccggaa caagaactgg gcaaactgcc gttgggttca cgtccggcga aacgtcgccc 2220

aaccggcggc gtcgagtcac tacgcgccat tccgtggatc ttcgcctgga cgcaaaaccg 2280

tctgatgctc cccgcctggc tgggtgcagg tacggcgctg caaaaagtgg tcgaagacgg 2340

caaacagagc gagctggagg ctatgtgccg cgattggcca ttcttctcga cgcgtctcgg 2400

catgctggag atggtcttcg ccaaagcaga cctgtggctg gcggaatact atgaccaacg 2460

cctggtagac aaagcactgt ggccgttagg taaagagtta cgcaacctgc aagaagaaga 2520

catcaaagtg gtgctggcga ttgccaacga ttcccatctg atggccgatc tgccgtggat 2580

tgcagagtct attcagctac ggaatattta caccgacccg ctgaacgtat tgcaggccga 2640

gttgctgcac cgctcccgcc aggcagaaaa agaaggccag gaaccggatc ctcgcgtcga 2700

acaagcgtta atggtcacta ttgccgggat tgcggcaggt atgcgtaata ccggctaatc 2760

ttcctcttct gcaaaccctc gtgcttttgg tcgatgcagg ggataatcgt cggtcgaaaa 2820

acattcgaaa ccacatatat tctgtgtgtt taaagcaaat cattggcagc ttgaaaaaga 2880

aggttcacat gtcaaacaac attcgtatcg aagaagatct gttgggtacc agggaagttc 2940

cagctgatgc ctactatggt gttcacactc tgagagcgat tgaaaacttc tatatcagca 3000

acaacaaaat cagtgatatt cctgaatttg ttcgcggtat ggtaatggtt aaaaaagccg 3060

cagctatggc aaacaaagag ctgcaaacca ttcctaaaag tgtagcgaat gccatcattg 3120

ccgcatgtga tgaagtcctg aacaacggaa aatgcatgga tcagttcccg gtagacgtct 3180

accagggcgg cgcaggtact tccgtaaaca tgaacaccaa cgaagtgctg gccaatatcg 3240

gtctggaact gatgggtcac caaaaaggtg aatatcagta cctgaacccg aacgaccatg 3300

ttaacaaatg tcagtccact aacgacgcct acccgaccgg tttccgtatc gcagtttact 3360

cttccctgat taagctggta gatgcgatta accaactgcg tgaaggcttt gaacgtaaag 3420

ctgtcgaatt ccaggacatc ctgaaaatgg gtcgtaccca gctgcaggac gcagtaccga 3480

tgaccctcgg tcaggaattc cgcgctttca gcatcctgct gaaagaagaa gtgaaaaaca 3540

tccaacgtac cgctgaactg ctgctggaag ttaaccttgg tgcaacagca atcggtactg 3600

gtctgaacac gccgaaagag tactctccgc tggcagtgaa aaaactggct gaagttactg 3660

gcttcccatg cgtaccggct gaagacctga tcgaagcgac ctctgactgc ggcgcttatg 3720

ttatggttca cggcgcgctg aaacgcctgg ctgtgaagat gtccaaaatc tgtaacgacc 3780

tgcgcttgct ctcttcaggc ccacgtgccg gcctgaacga gatcaacctg ccggaactgc 3840

aggcgggctc ttccatcatg ccagctaaag taaacccggt tgttccggaa gtggttaacc 3900

aggtatgctt caaagtcatc ggtaacgaca ccactgttac catggcagca gaagcaggtc 3960

agctgcagtt gaacgttatg gagccggtca ttggccaggc catgttcgaa tccgttcaca 4020

ttctgaccaa cgcttgctac aacctgctgg aaaaatgcat taacggcatc actgctaaca 4080

aagaagtgtg cgaaggttac gtttacaact ctatcggtat cgttacttac ctgaacccgt 4140

tcatcggtca ccacaacggt gacatcgtgg gtaaaatctg tgccgaaacc ggtaagagtg 4200

tacgtgaagt cgttctggaa cgcggtctgt tgactgaagc ggaacttgac gatattttct 4260

ccgtacagaa tctgatgcac ccggcttaca aagcaaaacg ctatactgat gaaagcgaac 4320

agtaatcgta cagggtagta caaataaaaa aggcacgtca gatgaaagct t 4371