一种高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium?glutamicum)NJ-M6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC?NO：M2013486，保藏日期为2013年10月22日，它是导入了来源于节杆菌的谷氨酸脱羧酶基因的谷氨酸棒杆菌。本发明还公开了上述重组谷氨酸棒杆菌的构建方法和应用。通过本发明方法，分批补料发酵液中γ-氨基丁酸的浓度可达36.1g/L，在相同培养条件下C.glutamicum?CICC10240基本不产γ-氨基丁酸。
【专利说明】—种高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法和在Y-氨基丁酸生产中的应用，属于生物发酵【技术领域】。
【背景技术】
[0002]Y-氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,GABA)又叫氨酪酸,属于氨基酸类衍生物，其分子式为C4H9NO2，相对分子质量为103.12。Y-氨基丁酸是一种重要的抑制性神经递质，对哺乳动物具有重要的生理调节作用，如降血压、改善睡眠和抗心率失常等；我国卫生部已经批准Y-氨基丁酸为新资源食品。近年来，Y-氨基丁酸的市场需求与日俱增。
[0003]Y-氨基丁酸的合成方法主要由化学合成法和生物合成法。化学合成法，一般分为两种，一种是Y-氯丁氰通过发生取代水反应来合成，将邻苯二甲酰亚氨钾与Y-氯丁氰在180°C反应，然后将产物与浓硫酸回流，再结晶提纯而得；另外一种是毗咯烷酮在氢氧化钙、碳酸氢铵的作用下水解开环制备获得。微生物合成法主要分为直接发酵法和全细胞转化法。利用全细胞转化法生产Y-氨基丁酸，得到的转化液成分相对简单，杂质含量较少，简化后提取分离步骤，降低了生产成本。直接发酵法合成Y-氨基丁酸得到的发酵液成分较复杂，会增加下游分离提取的成本，是Y-氨基丁酸工业化生产的瓶颈问题之一。
[0004]化学法虽然具有反应迅速的特点，但是由于该方法副反应较多，且有化学物质残留，即使得到纯品也不属于天然产物，同时，该反应对环境条件要求较为苛刻，且能耗高、危险系数高。与化学法相比，微生物法制备Y-氨基丁酸具有条件温和，安全性较高，生产成本较低等诸多优点。目前，Y-氨基丁酸的生产企业，大都采用微生物法，因此微生物发酵法最具有商业化开发应用前景。`
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题之一在于提供一株重组谷氨酸棒杆菌。
[0006]本发明要解决的技术问题之二在于提供上述重组菌的构建方法。
[0007]本发明要解决的技术问题之三在于提供所述重组谷氨酸棒杆菌在生产Y-氨基丁酸上的应用。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0009]一种高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutami cum) NJ-M6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013486，保藏日期为2013年10月22日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编 430072。
[0010]具体来说，所述的高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，它是导入了来源于节杆菌的谷氨酸脱羧酶基因的谷氨酸棒杆菌。
[0011]其中，所述的谷氨酸脱羧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。[0012]上述高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，它包括如下步骤:
[0013]1)构建含有谷氨酸脱羧酶的重组表达质粒；所述重组表达质粒是将谷氨酸脱羧酶基因gad基因插入pXJ19载体，得到重组质粒pXJ19-gad ；
[0014]2)将步骤I)构建得到的重组质粒转化入谷氨酸棒杆菌(购于中国工业微生物菌种保藏中心CICC，编号为10240)，得到产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌。
[0015]所述重组质粒为pXJ19_gad，该质粒由以下方法得到:以节杆菌(菌种编号；CGMCCN0.3584)基因组为PCR模板，PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因，然后构建入载体pXJ19中，得到重组质粒pXJ19-gad.[0016]上述谷氨酸棒杆菌感受态的制备:挑取新鲜平皿上谷氨酸棒杆菌C.glutamicumCICC10240，接种入含0.5%(质量体积比)葡萄糖的2ml液体LB培养基中，30°C，200r/min培养12小时，再按1%(接种量与培养基的体积百分比)接种到含3%(质量体积比)甘氨酸和0.1% (体积比)Tween80的50mL LB中，使起始OD600达到0.4，在30°C中继续培养至OD600达到0.9。将菌液冰浴20分钟，离心收集菌体，用预冷的10%体积百分比)甘油重悬细胞，用1.5ml离心管分装，每管80uL。将感受态细胞放_70°C冰箱保存或直接用于电击转化。
[0017]电击转化上述重组质粒pXJ19_gad:在1.8Kv, 5ms条件下使用电击仪(BioRad公司产品)将质粒pXJ19_gad转化入C.glutamicum CICC10240中。在含有25a g/mL卡那霉素的固体LB培养基上筛选出阳性克隆，得到重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6。并通过提取质粒的方法对该重组菌进行验证，结果表明，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6含有质粒pXJ19-gad。
[0018]所述PCR扩增的引物为:
[0019]正义链:5’-TCGCGGATCCGAATTCATGTCACACGGCGACGACGA-3，
[0020]反义链:3，-TGCGGCCGCAAGCTTTCAGCTTCCGCGTACTGCGG-5’
[0021]所述GAD基因如SEQ ID No:1所示。
[0022]上述高产Y -氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产Y -氨基丁酸中的应用。
[0023]上述发酵生产Y -氨基丁酸的方法包括如下步骤:
[0024]I)平板培养:将甘油管保藏的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)NJ-M6接种至LB培养基上，培养温度30°C，培养时间8_12个小时；
[0025]2)液体种子培养:将平板培养的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)NJ-M6接种至种子培养基中，培养温度30°C，培养时间8-12h ；
[0026]3)发酵产Y-氨基丁酸:将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5~10 (v/V) %，培养温度30°C，溶解氧水平控制在25%-45%的饱和度，12h和24h分别补加20g/L谷氨酸钠，并且12h后，pH控制在5.0,发酵时间40-60h。
[0027]其中，所述的LB培养基配方如下:1L蒸馏水中含IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOg氯化钠、15g琼脂粉，ρΗ7.0。
[0028]其中，所述的种子培养基配方如下:1L蒸馏水中含30g葡萄糖、IOg硫酸铵、5g蛋白胨、3.5g玉米衆、1.0g磷酸二氢钾、1.0g氯化钠，pH=7.0。
[0029]其中，所述的发酵培养基配方如下:1L蒸馏水中含30g葡萄糖、IOg谷氨酸钠、26g硫酸铵、20g玉米浆、4.5g磷酸二氢钾、2.5g硫酸镁，pH=7.0。
[0030]本发明的有益效果在于:[0031]本发明在谷氨酸棒杆菌(保藏编号:CICC10240)中表达谷氨酸脱羧酶基因，构建并筛选得到一株高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌c.glutamicum NJ-M6 ;补料分批发酵时，发酵液中Y-氨基丁酸的浓度可达36.lg/L。谷氨酸棒杆菌是国际公认的食品安全微生物；并且Y-氨基丁酸的产量高，底物转化率高，发酵工艺简单，具有良好的产业化应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为谷氨酸脱羧酶基因gad的电泳图,其中1，gad基因；2，Marker。
【具体实施方式】
[0033]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0034]实施例1:重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6的构建。
[0035]菌种:谷氨酸棒杆菌C.glutamicum CICC10240。
[0036]外源基因:节杆菌(菌种编号；CGMCC N0.3584)来源的谷氨酸脱羧酶基因gad。
[0037]载体:E.col i/C.glutamicum 穿梭载体 pXJ19。
[0038]以节杆菌CGMCC3584基因组为PCR模板，PCR扩增得到谷氨酸脱羧酶基因gad;电泳图见图1，gad基因的大小为1392bp。将gad片段两端分别接上EcoRI和HindIII位点，引物为:
[0039]正义链:5，-TCGCGGATCCGAATTCATGTCACACGGCGACGACGA-3，；
[0040]反义链:3，-TGCGGCCGCAAGCTTTCAGCTTCCGCGTACTGCGG-5，。
[0041]将得到的谷氨酸脱羧酶基因gad产物双酶切装入穿梭载体PXJ19中形成融合片段，并进行酶切、测序鉴定。
[0042]上述谷氨酸棒杆菌感受态的制备:挑取新鲜平皿上谷氨酸棒杆菌C.glutamicumCICC10240，接种入含0.5%(质量体积比)葡萄糖的2ml液体LB培养基中，30°C，200r/min培养12小时，再按1%(接种量与培养基的体积百分比)接种到含3%(质量体积比)甘氨酸和0.1% (体积比)Tween80的50mL LB中，使起始OD600达到0.4，在30°C中继续培养至OD600达到0.9。将菌液冰浴放置20分钟，离心收集菌体，用预冷的10%体积百分比)甘油重悬细胞，用1.5ml离心管分装，每管80uL。将感受态细胞放_70°C冰箱保存或直接用于电击转化。
[0043]电击转化上述重组质粒pXJ19_gad:在1.8Kv, 5ms条件下使用电击仪(BioRad公司产品)将质粒pXJ19_gad转化入C.glutamicum CICC10240中。在含有25a g/mL卡那霉素的固体LB培养基上筛选出阳性克隆，得到重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6。并通过提取质粒的方法对该重组菌进行验证，结果表明，重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6含有质粒pXJ19-gad。
[0044]实施例2:
[0045]本实施例说明谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6补料发酵生产Y-氨基丁酸的工艺。[0046]本实施例所述的培养基配方(％为质量百分比):
[0047]固体平板培养基:1L蒸馏水中含:1L蒸馏水中含IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg氯化钠，15g琼脂粉，ρΗ7.0。
[0048]种子培养基:1L蒸懼水中含30g葡萄糖，IOg硫酸铵,5g蛋白胨,3.5g玉米衆,1.0g磷酸二氢钾，1.0g氯化钠，pH=7.0。
[0049]发酵培养基:1L蒸馏水中含30g葡萄糖，IOg谷氨酸钠，26g硫酸铵，20g玉米浆，
4.5g磷酸二氢钾，2.5g硫酸镁，pH=7.0。
[0050]将甘油管保藏的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6接种至LB培养基上,培养温度30度，培养时间8-12个小时；将平板培养的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum NJ-M6接种至种子培养基中，500mL摇瓶装液量IOOmL,培养温度30度，转速250rpm，培养时间8_12个小时；然后转接发酵培养基中发酵，接种量5% (v/v),2L发酵罐装液量1L，溶解氧水平控制在40%的饱和度，12h和24h分别补加20g/L谷氨酸钠，并且12h后，pH控制在5.0(用2M浓硫酸和NaOH来调节)；发酵时间50h后，检测Y-氨基丁酸产量；发酵液中Y-氨基丁酸的含量可达36.lg/L,而同等培养条件下，出发菌株重组谷氨酸棒杆菌C.glutamicum CICC10240基本不产Y-氨基丁酸。`
【权利要求】
1.一种高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) NJ-M6，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2013486，保藏日期为 2013 年 10 月 22 日。
2.根据权利要求1所述的高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，它是导入了来源于节杆菌的谷氨酸脱羧酶基因的谷氨酸棒杆菌。
3.根据权利要求2所述的高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
4.权利要求1所述高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，它包括如下步骤: 1)构建含有谷氨酸脱羧酶的重组表达质粒；所述重组表达质粒是将谷氨酸脱羧酶基因gad基因插入pXJ19载体，得到重组质粒pXJ19-gad ； 2)将步骤I)构建得到的重组质粒转化入谷氨酸棒杆菌，得到产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌。
5.权利要求1所述的高产Y-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产Y-氨基丁酸中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵生产Y-氨基丁酸的方法包括如下步骤: 1)平板培养:将甘油管保藏的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutami cum) NJ-M6接种至LB培养基上，培养温度30°C，培养时间8-12个小时；` 2)液体种子培养:将平板培养的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutami cum) NJ-M6接种至种子培养基中，培养温度30°C，培养时间8-12h ； 3)发酵产Y-氨基丁酸:将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5~10 (v/v) %，培养温度30°C，溶解氧水平控制在25%-45%的饱和度，12h和24h分别补加20g/L谷氨酸钠，并且12h后，pH控制在5.0,发酵时间40-60h。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的LB培养基配方如下:1L蒸馏水中含IOg蛋白胨、5g酵母粉、IOg氯化钠、15g琼脂粉，pH7.0。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的种子培养基配方如下:1L蒸馏水中含30g葡萄糖、IOg硫酸铵、5g蛋白胨、3.5g玉米楽；、1.0g磷酸二氢钾、1.0g氯化钠，pH=7.0。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基配方如下:IL蒸馏水中含30g葡萄糖、IOg谷氨酸钠、26g硫酸铵、20g玉米浆、4.5g磷酸二氢钾、2.5g硫酸镁，pH=7.0。
【文档编号】C12N15/77GK103555647SQ201310545908
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】谢婧婧, 郭亭, 周韬玉, 陈可泉, 周治, 冯晓慈 申请人:南京工业大学