一种通过漆酶降解提高木质素抗氧化活性的方法与流程

本发明涉及一种提高木质素抗氧化活性的方法，特别涉及一种通过漆酶降解提高木质素抗氧化活性的方法。
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：木质素和纤维素、半纤维素是植物骨架的三大主要成分，一起支撑着植物生长。在木本植物中，木质素占到25％，是仅次于纤维素的第二大有机物，而且每年都以500亿吨的速度再生。制浆造纸工业每年要从植物中分离出5000万吨左右的木质素副产品，但迄今为止，超过95％的木质素仍以“黑液”直接排入江河或浓缩后烧掉，很少得到有效利用。随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入，天然高分子所具有的可再生、可降解性等性质日益受到重视。废弃物的资源化与可再生资源的利用，是当代经济与社会发展的重大课题，也是对当代科学技术提出的新要求。木质素是由苯丙烷类结构单元组成的复杂天然高聚物，有三种基本结构单元：愈创木基木质素、紫丁香基木质素、对羟苯基木质素。每一种来源不同的木质素都是由这三种基本结构按不同的比例组成的。在木质素结构单元及其侧链上含有丰富的活性官能团，包括酚羟基、醇羟基、羧基、羰基和甲氧基等。酶降解是处理工业废弃木质素的一种手段，最主要的三种公认木质素降解酶包括木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(laccase)。如果从节能、环保角度分析的话，漆酶降解处理木质素是一种很好的手段。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，对其作用机理尚不十分清楚，有两种主流观点，认为漆酶催化机理是底物自由基中间体的产生和O2还原成H2O。据统计它的催化氧化的底物达到250多个，最重要的是酚及其衍生物，约占其底物总数的一半。多酚类物质具有清除自由基的作用，可以通过酚羟基提供质子，从而清除自由基，因此可作为抗氧化剂应用到医药、食品等领域。目前在食品、医药方面使用量最多的还是人工合成的抗氧化剂，但是，随着医学毒理学和生物学研究的不断深入发现，包括国际允许使用的大多数种类的人工合成抗氧化剂对人体都有不同程度的伤害，表现在致癌、致畸和致突变方面，该问题已经引起人们的高度重视。然而，天然抗氧化剂的毒性却远远低于人工合成的，属于绿色、环保、无毒型抗氧化剂。因此，天然抗氧化剂的开发与研究是对消费者内心不安有着积极的作用，同时也具有很大的消费市场潜力，日益受到国内外研究机构和专家们的认同。木质素的结构与酚类有相似之处，所以木质素也具有抗氧化性，但是木质素的抗氧化活性并不高，如何提高其抗氧化活性，对于木质素能应用到抗氧化剂领域是一个需要解决的问题。抗氧化剂被广泛应用到药品、食品中，与人类生活有着密切关系。美国科学家Harman博士在1955年提出衰老的自由基理论，他认为人类的衰老与氧自由基对细胞内的有害进攻有关，如果维持体内正常水平的抗氧化剂和自由基清除剂的话，人类就可以延长寿命和推迟衰老。例如，维生素E、β-胡萝卜素、白芦藜醇、茶多酚等天然抗氧化剂均对抗衰老有一定的作用。食物的腐败、变质也与油脂氧化有关。油脂中的不饱和脂肪酸极易氧化生成氢过氧化物，进而分解为低级脂肪酸和醛、酮类物质，导致食品发生酸败。目前储藏食品最常用的方法就是采用添加抗氧化剂，它能够有效延缓甚至阻遏食品氧化而引发的腐败、变质。例如，人工合成的抗氧化剂BHT(二丁基羟基甲苯)、BHA(丁基羟基茴香醚)、TBHQ(叔丁基对苯二酚)等。公开于该
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部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。技术实现要素：本发明针对上述技术问题，发明一种通过漆酶降解提高木质素抗氧化活性的方法，旨在得到一种能提高木质素的抗氧化活性、提高木质素的附加价值的方法。为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种通过漆酶降解提高木质素抗氧化活性的方法，包含以下操作步骤：(1)将醋酸溶液加入氢氧化钠溶液中，调节pH为4.4～6.0，即得缓冲试剂；(2)向步骤(1)中所得缓冲试剂中加入木质素，配制成浓度为0.1～1g/mL的木质素溶液或木质素悬浮液；(3)按照每克干重木质素添加0.2～1.6ml漆酶液的用量向步骤(2)中所得木质素溶液中加入漆酶液，然后在20～50℃下缓慢搅拌反应1～40h，将反应后所得反应液置于沸水浴中5～20min，终止反应。(4)步骤(3)沸水浴后反应所得溶液冷却后，静置过夜，倒掉上层清液，抽滤，洗涤，烘干，磨成粉末，即得。其中，步骤(1)中所述的氢氧化钠溶液浓度为0.1mol/L。其中，步骤(1)中所述的醋酸溶液浓度为0.1mol/L。其中，步骤(2)中所述的木质素为碱木质素、水解木质素或有机木质素中的一种。其中，步骤(2)中所述木质素为碱木质素时，步骤(4)操作为步骤(3)沸水浴后反应所得溶液冷却后，加入稀酸使得木质素析出，直至溶液颜色发生明显变化，即由黑褐色变成棕黄色，停止滴加稀酸，静置过夜后，倒掉上层清液，抽滤，洗涤，烘干，磨成粉末，即得。其中，所述的稀酸为稀盐酸或稀硫酸。其中，步骤(4)中所述的烘干为50～60℃烘干过夜。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过漆酶降解木质素达到提高其抗氧化活性的目的，为木质素往天然、可再生抗氧化剂领域发展提供有力支持，提高了利用率和增加经济效益，同时还能够解决工业废弃木质素给环境带来的环境污染问题；进一步的，漆酶处理木质素过程能耗低，过程操作简易，不产生有害物质，属于节能环保型处理手段。附图说明图1是碱木质素(AL)抗氧化活性的表征清除率-浓度曲线。图2是本发明实施列1制备所得降解后的碱木质素(DAL)抗氧化活性的表征清除率-浓度曲线。具体实施方式下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例1一种通过漆酶降解提高木质素抗氧化活性的方法，操作步骤如下：(1)用移液管取0.6mL的冰醋酸，溶解在99.4mL的蒸馏水中，制得浓度为0.1mol/L的醋酸溶液；用分析天平称量0.4g氢氧化钠固体，溶解在100mL蒸馏水中，得浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，然后边磁力搅拌边将所得醋酸溶液滴加到所得氢氧化钠溶液中，同时pH计实时记录溶液pH值，待pH＝4.4～6.0时，停止滴加醋酸溶液，即得缓冲试剂；(2)称量5g碱木质素，溶解在50mL步骤(1)所得的缓冲试剂中，震荡10～20min，使碱木质素充分溶解在缓冲试剂中，配制成浓度为0.1g/mL的碱木质素溶液；(3)按照每克干重木质素添加1.6mL漆酶液的用量向步骤(2)中所得木质素溶液中加入漆酶液，然后在20℃下缓慢搅拌反应40h，将反应后所得反应液置于沸水浴中5min，终止反应；(4)步骤(3)沸水浴后反应所得溶液冷却后，边磁力搅拌边滴加稀盐酸溶液使得木质素析出，直到溶液颜色发生明显变化，即黑褐色变成棕黄色后，停止滴加稀酸，静置过夜后，倒掉上层清液，然后进行抽滤，得到的滤饼用蒸馏水多次洗涤，50℃烘干过夜，磨成粉末，即得。实施例2一种通过漆酶降解提高木质素抗氧化活性的方法，操作步骤如下：(1)用移液管取0.6mL的冰醋酸，溶解在99.4mL的蒸馏水中，制得浓度为0.1mol/L的醋酸溶液；用分析天平称量0.4g氢氧化钠固体，溶解在100mL蒸馏水中，得浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，然后边磁力搅拌边将所得醋酸溶液滴加到所得氢氧化钠溶液中，同时pH计实时记录溶液pH值，待pH＝4.4～6.0时，停止滴加醋酸溶液，即得缓冲试剂；(2)称量50g水解木质素，溶解在50mL步骤(1)所得的缓冲试剂中，震荡10～20min，使水解木质素充分浸入缓冲试剂中，配制成浓度为1g/mL的水解木质素悬浮液；(3)按照每克干重木质素添加0.2mL漆酶液的用量向步骤(2)中所得木质素悬浮液中加入漆酶液，然后在50℃下缓慢搅拌反应1h，将反应后所得反应液置于沸水浴中20min，终止反应；(4)步骤(3)沸水浴后反应所得溶液冷却后，静置过夜，倒掉上层清液，然后进行抽滤，得到的滤饼用蒸馏水多次洗涤，60℃烘干过夜，磨成粉末，即得。实施例3一种通过漆酶降解提高木质素抗氧化活性的方法，操作步骤如下：(1)用移液管取0.6mL的冰醋酸，溶解在99.4mL的蒸馏水中，制得浓度为0.1mol/L的醋酸溶液；用分析天平称量0.4g氢氧化钠固体，溶解在100mL蒸馏水中，得浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，然后边磁力搅拌边将所得醋酸溶液滴加到所得氢氧化钠溶液中，同时pH计实时记录溶液pH值，待pH＝4.4～6.0时，停止滴加醋酸溶液，即得缓冲试剂；(2)称量30g有机木质素，溶解在50mL步骤(1)所得的缓冲试剂中，震荡10～20min，使有机木质素充分浸入缓冲试剂中，配制成浓度为0.6g/mL的有机木质素悬浮液；(3)按照每克干重木质素添加0.9mL漆酶液的用量向步骤(2)中所得木质素悬浮液中加入漆酶液，然后在35℃下缓慢搅拌反应21h，将反应后所得反应液置于沸水浴中10min，终止反应；(4)步骤(3)沸水浴后反应所得溶液冷却后，静置过夜，倒掉上层清液，然后进行抽滤，得到的滤饼用蒸馏水多次洗涤，55℃烘干过夜，磨成粉末，即得。检测——抗氧化活性的表征方法实验步骤：(1)溶液配制DPPH溶液：用无水乙醇配制200ug/mL的DPPH溶液，备用，测抗氧化性时，稀释成50ug/mL。样品溶液：称量适量碱木质素(AL)和本发明实施例1制备所得产品，即降解碱木质素(DAL)，分别将其溶解在体积浓度为50％乙醇中，分别配制成0.5mg/mL溶液，震荡，使之充分溶解，然后用0.22μm滤膜过滤，即得样品液。(2)测吸光值①每个样品分别测三个吸光值：A0：3mlDPPH，用无水乙醇定容至5mlAL：0.1-1.0ml样品，用无水乙醇定容至5mlAi：3mlDPPH+0.1-1.0ml样品，用无水乙醇定容至5ml反应40min之后，于515nm测它们的吸光值；②根据公式RSA(％)＝[1-(Ai-AL)/A0]*100计算各个样品各个浓度对应的清除率。(3)实验结果得到结果之后，做清除率-浓度曲线，如图1和图2，利用logistic函数拟合，可得到IC50值，如表1中所示：表1IC50μg/mLR2AL851.30.9959DAL58.280.9917比较表1中的IC50值，即能清除50％DPPH自由基的抗氧化剂浓度，IC50值越小，抗氧化活性越强。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。当前第1页1 2 3