Carabin在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种Carabin(也称作TBC1D10C或者Carabin)作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中应用。

背景技术：

非酒精性脂肪肝(NAFLD,nonalcoholic fatty liver disease)是一组除外酒精和其他明确的肝损因素所致的，以肝细胞内脂肪过度沉积(脂肪浸润的肝细胞占总肝细胞的5％以上)为主要特征的代谢综合征。调查显示，NAFLD在非肥胖人群中的发病率为10％～20％，在25kg/m²＜身体质量指数(BMI，body mass index)＜30kg/m²的人群中约为63.4％，而在BMI＞30kg/m²人群中约为89.1％，NAFLD在Ⅱ型糖尿病患者中的发病率约为50％[1]。儿童NAFLD的发病率也呈上升趋势，约3％，并可能随着年龄增长而增加[2]。研究表明，超过90％的肥胖Ⅱ型糖尿病患者同时患有NAFLD。可见，NAFLD、Ⅱ型糖尿病以及肥胖三者关系紧密。此外，NAFLD常与其他代谢性综合征并存或者相互影响，如腹型肥胖、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受不良、Ⅱ型糖尿病以及致动脉粥样硬化的脂质代谢紊乱。NAFLD是非酒精性脂肪肝炎(NASH,nonalcoholic steatohepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)以及肝癌(hepatocellular carcinoma)三部曲的主要诱发因素。在发达国家和发展中国家，随着人们饮食方式和膳食结构的改变，NAFLD已成为损害肝功能的最常见原因。专家预测，至2020年NAFLD将成为肝脏衰竭需行肝脏移植手术治疗的主要病原学因素。为此，NAFLD是当代医学领域的新挑战，其对人类健康的危害将不断增加。

Ⅱ型糖尿病旧称非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM,noninsulin-dependent diabetes mellitus)或成人发病型糖尿病(adult-onset diabetes)，是一种代谢性疾病，多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。Ⅱ型糖尿病最显著的特征为高血糖，主要由胰岛素抵抗及胰岛素相对缺乏引起，目前被认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。研究表明，NAFLD是Ⅱ型糖尿病的独立风险因素之一，防治NAFLD可以减少Ⅱ型糖尿病的发生发展。因而研究Ⅱ型糖尿病与NAFLD之间的关系以及防治Ⅱ型糖尿病的慢性并发症显得尤为重要。治疗上，目前暂无特效药，控制体重以及生活干预仍然是最主要的防治手段，一些改善胰岛素抵抗的药物能够有效控制血糖，调节脂代谢紊乱，改善肝脏酶学，对于防治NAFLD有重要意义。但数据大多来自临床前研究，缺乏临床试验的支持。

CABABIN，是TBC结构域家族成员之一，CABABIN既能与Calcineurin(钙调神经磷酸酶)结合相互作用，又能与Ras(rat sarcoma，一种小G蛋白)结合相互作用，上述两类结合归因于CABABIN所具有的两个结构域，氨基端89至294位氨基酸构成的Ras/Rab(Rab与Ras结构类似，同为一种小G蛋白)GAP(GTPase-activating protein)domain和羧基端406至446位氨基酸构成的domain(主要与Calcineurin相互作用)。CABABIN最早通过酵母双杂交系统被筛选作为Calcineurin的相互作用蛋白质；研究表明，CABABIN通过406至446位氨基酸与Calcineurin结合并抑制Calcineurin的磷酸化活性，通过89至294位氨基酸与RAS结合并抑制RAS活性，即CABABIN通过抑制Calcineurin和RAS活性从而在T细胞抗原受体信号通路中发挥重要作用[3]。同时，CABABIN作为Rab35蛋白的GAP，能够与Rab35作用促进T细胞与APC(antigen-presenting cells)之间免疫突触的形成[4]；研究还表明，CABABIN依赖它的Rab35-GAP活性，能够促使小电导钙激活钾通道3(KCa2.3,small conductance calcium-activated potassium channel 3)的胞吞和降解，从而在微血管紧张度和血压的维持过程中发挥重要作用[5]。在B细胞中CABABIN基因敲除会增强BCR(B cell receptor)-TLR9(Toll样受体9)共同刺激诱导的自身免疫，缺失CABABIN的B细胞经TLR9(Toll样受体9)激动剂CpG-DNA刺激后，会加速B细胞的早期响应，从而使小鼠易于患自身免疫性疾病[6]。已有研究表明calcineurin介导的通路是心肌肥厚发生、发展的关键性途径[7,8]心脏特异性的CABABIN过表达能够通过抑制calcineurin作用降低压力负荷引起的心肌肥厚的发生发展[]。

参考文献：

[1]Eguchi Y,Hyogo H,Ono M,et al.Prevalence and associated metabolic factors of nonalcoholic fatty liver disease in the general population from 2009 to 2010 in Japan:a multicenter large retrospective study[J].J Gastroenterol,2012,47(5):586-595.

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[4]Patino-Lopez G,Dong X,Ben-Aissa K,et al.Rab35 and Its GAP Carabin in T Cells Regulate Receptor Recycling and Immunological Synapse Formation[J].Journal of Biological Chemistry,2008,283(26):18323-18330.

[5]Gao Y,Bertuccio C A,Balut C M,et al.Dynamin-and Rab5-dependent endocytosis of a Ca2⁺-activated K⁺channel,KCa2.3[J].PLoS One,2012,7(8):e44150.

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[10]Zhu X,Fang J,Gong J,et al.Cardiac-Specific Carabin Blunts Pressure Overload–Induced Cardiac HypertrophyNovelty and Significance[J].Hypertension,2016,67(5):866-877.

技术实现要素：

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种Carabin基因的表达与脂肪肝和Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的靶基因Carabin的新用途，进而把Carabin基因应用于脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的治疗。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以基因敲除的工具鼠Alb-cre小鼠与Carabin肝细胞特异性基因敲除小鼠(Carabin-KO)为实验对象，通过高脂饮食(High fat diet)诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究Carabin基因的功能，结果发现与Alb-cre小鼠相比，Carabin-KO小鼠表现出肥胖，其体重及空腹血糖水平明显高于高脂饲料饲养的Alb-cre小鼠，进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现Carabin基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从小鼠小鼠肝脏大体外观，肝脏重量及肝脏/体重比以及病理染色结果等均表明高脂饮食诱导后Carabin-KO小鼠脂肪肝病变更严重，脂质蓄积显著增加。以上这些结果表明肝细胞特异性Carabin基因敲除会加剧脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的发生，Carabin基因能够抑制脂肪肝和Ⅱ型糖尿病。

本发明人的研究证明了：在高脂饮食诱导的脂肪肝和Ⅱ型糖尿病模型中，Carabin具有抑制肥胖，减少肝脏脂质蓄积，保护肝脏功能；降低血糖，增强葡糖耐受的作用。

针对Carabin的上述功能，提供Carabin作为药物靶标在筛选保护肝脏及维持糖代谢稳态的药物中的应用。

针对Carabin的上述功能，提供Carabin作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

以上药物是指能够促进Carabin基因表达的药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现Carabin基因的新功能，即Carabin基因具有能够抑制脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病的作用。

(2)基于Carabin在够抑脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。

附图说明

图1是Alb-cre和Carabin-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图；A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图(*：p＜0.05 vs Alb-cre NC组，**：p＜0.01 vs Alb-cre NC组，#：p＜0.05 vs Alb-cre HFD组，##：p＜0.01 vs Alb-cre HFD组)。

图2是Alb-cre和Carabin-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量实验结果图；A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve,AUC)比较图(**：p＜0.01 vs Alb-cre NC组，##：p＜0.01 vs Alb-cre HFD组)。

图3是Alb-cre和Carabin-KO小鼠肝脏重量、肝脏重/体重比图；A为肝脏重量、B为肝脏重量与体重比值统计柱状图(##：p＜0.01 vs Alb-cre HFD组)。

图4是Alb-cre和Carabin-KO小鼠肝脏组织HE和油红O染色图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实验用动物及饲养：

实验动物种属，性别，周龄和来源：C57BL/6小鼠、肝细胞特异性Carabin基因敲除(Carabin-KO)小鼠和肝细胞特异性表达的Cre转基因小鼠(Alb-Cre)(购自The Jackson Laboratory，货号003574)，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；肝细胞特异性Carabin基因敲除小鼠由本中心自主构建。

肝细胞特异性Carabin基因敲除小鼠(Carabin-KO)由Carabin-flox小鼠(构建过程参见文献：Zhu X,Fang J,Gong J,et al.Cardiac-Specific EPI64C Blunts Pressure Overload–Induced Cardiac Hypertrophy[J].Hypertension,2016,67(5):866-877的Online Supplement)与Alb-Cre杂交得到。将上述Carabin-flox小鼠与肝脏特异性Alb-Cre转基因小鼠交配，筛选得到Carabin^flox/flox/Alb-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到肝细胞特异性Carabin基因敲除小鼠。

实验动物饲料配方：高脂饲料(High fat diet，HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质20％，碳水化合物20％，脂肪60％；总的热量质量比5.24kcal/g。低脂饲料(Normal chow，NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质20％，碳水化合物70％，脂肪10％；总的热量质量比3.85kcal/g。

动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级动物实验中心。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。

【实施例1】小鼠脂肪肝和2型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)获得

(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，Alb-cre小鼠和Carabin-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即Alb-cre NC组，Carabin-KO NC组，Alb-cre HFD组，Carabin-KO HFD组共4个组别。

(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：

采用Alb-cre和Carabin-KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确Carabin基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，Alb-cre小鼠和Carabin-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即Alb-cre NC组，Carabin-KO NC组，Alb-cre HFD组，Carabin-KO HFD组共4个组别。小鼠空腹体重和空腹血糖每隔2周检测1次。实验第10周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。待IPGTT实验完毕，取出小鼠肝脏，一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue Freezing Medium)包埋作为病理分析用。

【实施例2】小鼠体重、血糖水平测定

(1)小鼠空腹体重检测

①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。

②称重：分别在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。

(2)空腹血糖水平检测实验

将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条的相对应代码，随后显示滴血图案，提示血糖仪器处于待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：使用眼科剪刀迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处将鼠尾剪下，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，体重、血糖变化结果如图1所示，Alb-cre小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第4周开始体重明显高于其NC饲料组，给与Carabin-KO小鼠12周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第2周开始HFD组的Carabin-KO小鼠体重明显高于HFD组的Alb-cre小鼠体重，一直持续到第12周(见图1A)；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠在第2周、4周、6周、8周、10周、12周的空腹血糖水平明显比相应NC对照组升高，且HFD组的Carabin-KO小鼠空腹血糖水平也明显高于Alb-cre小鼠空腹血糖水平(见图1B)。表明肝细胞特异性Carabin基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，Carabin基因能显著提高小鼠的糖代谢稳态，表明Carabin在高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要保护作用。

【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

实验第10周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。

(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。

(2)先检测进行葡萄糖注射前即0分钟时空腹血糖水平，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行小段距离，穿过腹部中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(4)分别于腹腔注射后15、30、60、120分钟时间点剪去尾部测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。

进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance tests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第10周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的Alb-cre小鼠和Carabin-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，Alb-cre小鼠在2小时时恢复至空腹血糖水平，且Carabin-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于高于Alb-cre小鼠的血糖水平(图2A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(area under the curve，AUC)，发现Alb-cre小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，Carabin-KO HFD组的AUC显著大于Alb-cre HFD组的AUC(图2B)，表明Carabin可维持糖代谢稳态。

【实施例4】肝脏大体外观及肝脏组织脂质成分测定

(1)终末肝脏组织取材

①小鼠称重后，迅速使用颈椎脱臼法将其处死。仰卧位固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。

②用镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

③迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养器皿中，迅速称重。

④石蜡标本：切取部分肝脏置于10％中性福尔马林中固定。冰冻标本：切取部分肝脏，置于有OCT的锡纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。

(2)肝脏组织处理及病理染色相关实验

①肝脏脱水，透明，浸蜡

切取10％中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水下冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置程序，①脱水：75％酒精(45分钟)→75％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无水酒精(1小时)；②透明：二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时)；③浸腊(65℃)：石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出盛放组织的包埋框，送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。

②肝脏组织切片

使用切片机切片(切片厚度5μm)。

③肝脏组织苏木素-伊红(HE)染色

将肝脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30分钟)→二甲苯中(5分钟×3次)→100％酒精(1分钟)→90％酒精(1分钟)→70％酒精(1分钟)→蒸馏水洗→苏木素(5分钟)→自来水洗去切片上的浮色→1％盐酸酒精(1至3秒)→自来水洗数下→Scott液(碳酸氢钠0.35g，硫酸镁2g，蒸馏水100mL)(1分钟)→自来水洗数下→伊红(1分钟)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分钟×3次)→在二甲苯未干时封片，拍照。

④肝脏组织油红O染色

a.将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30分钟，4％多聚甲醛固定10分钟。置于双蒸水中洗10分钟，以除去组织表明的多聚甲醛。

b.以60％异丙醇处理1分钟。

c.用油红O(公司sigma，货号O0625，浓度0.5克/100mL 100％异丙醇)染色30分钟。之后以60％异丙醇漂洗1分钟×3次，直至背景干净。

d.用Mayer’s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。

e.水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。

f.用甘油明胶封片，拍照。

肝脏大体外观结果见图3所示，通过取材称重，观察到在HFD组的Carabin-KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠体重比值均较HFD组的Alb-cre小鼠高。进一步通过组织切片，进行HE和油红O染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织在高脂饮食饲养条件下发生了显著的病理改变。通过肝脏HE染色，可以观察到在HFD饲养条件下，Alb-cre小鼠和Carabin-KO小鼠肝脏组织均有脂肪沉积，可以看到Alb-cre组小鼠的肝细胞发生脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态几乎完全破坏，而Carabin-KO组小鼠的肝细胞形态变化更为严重(如图4上)。通过肝脏油红O染色来检测肝组织中脂质，可以发现在HFD组的Alb-cre小鼠的肝门静脉周围呈大片红色，提示有大量的脂质沉积，而在HFD组的Carabin-KO小鼠的肝门静脉周围的脂质沉积更显著(如图4下)。这些结果说明肝细胞特异性Carabin基因敲除小鼠的脂肪肝明显恶化。

上述结果显示Carabin-KO小鼠在HFD的诱导下发生的脂肪肝病变和Ⅱ型糖尿病显著加重。这些结果表明Carabin基因对改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明Carabin基因在脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。