本发明属于分子诊断和基因诊断领域，涉及一种用于检测非小细胞肺癌患者样本中EGFR基因T790M点突变的一组基于ARMS荧光定量PCR检测EGFR基因T790M突变的引物组及其制备方法。
背景技术：
非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤。近年来，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factorreceptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)在NSCLC患者的治疗中得到了广泛的应用。
EGFR-TKI能够有效延缓晚期NSCLC的进展并延长患者生存期。EGFR-TKI的疗效很大程度上取决于EGFR的突变状态。早期临床研究显示，女性，亚裔，非吸烟或少吸烟，腺癌的NSCLC患者对吉非替尼(Gefitinib)有较高的反应率。随后发现，EGFR突变与吉非替尼的疗效具有明显的相关性。非小细胞肺癌患者EGFR基因上18/19/20/21外显子上的突变与EGFR-TKI的治疗效果显著相关。其中18，19，21号外显子上的突变为药物敏感性突变，20号外显子上的突变为耐药突变。
美国国家癌症综合网络发布的《非小细胞肺癌NCCN指南》中指出，对于EGFR敏感突变的患者，一线均推荐使用吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼，与化疗相比，靶向治疗有更好的疗效和更少的毒副作用。但靶向药物服用约8-16个月后，患者一般会发生耐药。其中主要是EGFR T790M耐药突变，使得非小细胞肺癌患者对吉非替尼和厄洛替尼产生抗性，但Osimertinib(AZD9291)对携带EGFR T790M的患者有很好的治疗效果。因此对T790M的点突变检测，有助于指导用药。
目前，EGFR突变的检测方法仍以组织检查为金标准，但组织标本突变的检测由于获取的组织量不足，获组织部位不理想，因此具有一定局限性。此外还有sanger测序法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、ARMS法、Real-time PCR法、DHPLC等方法。其中，sanger测序法可以直接通过测序获得样本突变信息，但该方法要求样本为肿瘤组织，而且敏感性不高，只能检测到突变频率在10％以上的突变，容易受到背景DNA的影响，不宜用于肿瘤组织外的其他样本。除了直接测序法之外，PCR-SSCP和PCR-RFLP法也仅见到用于肿瘤组织的检测，未见有在其他标本中检测的介绍。ARMS荧光定量PCR法具有特异性强、灵敏度高、重复性好，可以准确检测到突变频率为1％甚至更低的突变，用时短，只需2小时左右可以完成对样品的检测。
因此本发明利用了该技术的上述优点，将其应用于EGFR基因T790M点突变的检测。ARMS引物设计时将3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效扩增。但是对于替换突变，如EGFR的T790M突变,与突变模板完全匹配的ARMS引物仍然能以野生型DNA为模板发生有效扩增。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对目前检测EGFR基因T790M突变的方法所存在的不足而提供一种基于ARMS荧光定量PCR检测EGFR基因T790M突变的引物组。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
一组用于检测EGFR基因T790M点突变的引物组，其包含以下引物：
T790M-F:CTCCACCGTGCAGCTCATCTT；
T790M-R:TGCACACACCAGTTGAGCAGGT；
TaqMan-MGB探针1：TCGGCTGCCTCCTGGA；
其中T790M-R为野生型下游引物，上游引物T790M-F为ARMS引物，在3’端第二位额外引入错配碱基T，使对于野生型模板，有2个错配碱基，扩增效率明显下降；而对于T790M突变的模板，只有一个错配，且不在3’末端，仍能特异性扩增；从而能够灵敏检测5ng DNA样品中低至1％的T790M突变。
在本发明的一个优选实施例中，在EGFR无突变的28号外显子上设计了一对引物和一条探针，作为内参，所述引物和探针序列如下：
E28-F:CGAGTATCTCAACACTGTCCAGC；
E28-R:GAAAGAAGTCCTGCTGGTAGTCAG；
TaqMan-MGB探针2：CATTCGACAGCCCTGC。
上述引物和探针的合成均采用固相亚磷酰胺三酯法。具体步骤如下：
1)用三氯乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
2)将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5'-羟基发生缩合反应；
3)由于无法保证百分之百的5'-羟基都参与缩合，可能有极少数5'-羟基没有参加反应，可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；
4)在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基连接完成。
所有合成的引物选择PAGE纯化方式，TaqMan-MGB探针是在引物5’端标记FAM,3’端标记MGB制得。引物和探针用1×TE稀释成10μM备用。
利用本发明的引物来检测的方法如下：
1.对被检样品的预处理：用常规法快速提取样本DNA；
2.荧光定量PCR反应体系(20μL):
3.PCR反应程序：50℃，2min；95℃预变性10min；40cycles:95℃,15sec、60℃30sec(收集荧光)。
4.反应分2管进行，T790M检测反应和内参E28。
5.样本Ct(E28)<30时结果有效。如果样本Ct(E28)>30,应该增加模板的量，保证每一管中模板量至少为5ng。依据公式△Ct值＝Ct(T790M)－Ct(E28)野生型计算△Ct值；若△Ct>9.0，判定为无突变，若△Ct≤9.0，判定为突变。
本发明的有益效果：①高准确性：准确鉴定突变，假阳性率为0；②快速、高效扩增：扩增仅需1小时即可完成；③灵敏度高：对EGFR基因的最低检测极限达到10个拷贝以内；④鉴定简便：通过△Ct值判读；⑤用途广，可广泛用于临床的常规检测及流行病学调查。
附图说明
图1是本发明实施例各样本检测结果图。
其中，A为样本1的检测结果，B为样本2的检测结果，C为样本3的检测结果，D为样本4的检测结果。
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的技术应用不仅限于实施例。
实施例1
1.T790M-F:CTCCACCGTGCAGCTCATCTT
2.T790M-R:TGCACACACCAGTTGAGCAGGT
3.TaqMan-MGB探针1：TCGGCTGCCTCCTGGA
4.E28-F:CGAGTATCTCAACACTGTCCAGC
5.E28-R:GAAAGAAGTCCTGCTGGTAGTCAG
6.TaqMan-MGB探针2：CATTCGACAGCCCTGC
上述引物和探针的合成均采用固相亚磷酰胺三酯法。具体步骤如下：
1)用三氯乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
2)将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5'-羟基发生缩合反应；
3)由于无法保证百分之百的5'-羟基都参与缩合，可能有极少数5'-羟基没有参加反应，可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；
4)在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基连接完成。
所有合成的引物选择PAGE纯化方式，TaqMan-MGB探针是在引物5’端标记FAM,3’端标记MGB制得。引物和探针用1×TE稀释成10μM备用。
实施例2：荧光定量PCR快速检测EGFR基因T790M点突变
步骤一：被检样品预处理
按照常规方法提取样本DNA。
其中样本如下：
样本1：去除DNAase的无菌双蒸水
样本2：不存在EGFR基因T790M突变的样本
样本3：1％T790M突变频率的cfDNA标准品
样本4：5％T790M突变频率的cfDNA标准品
步骤二：荧光定量PCR反应体系配置
荧光定量PCR反应体系(20μL):
T790M检测反应和内参E28反应分2管配置。每个样品都要进行这2个反应。
步骤三：荧光定量PCR反应进行
将步骤二中配置的反应液在Stepone Plus荧光定量PCR仪中按以下程序反应：50℃，2min；95℃预变性10min；40cycles:95℃,15sec、60℃30sec(收集荧光)。
步骤四：结果判定
样本1的结果见图1A，E28和T790M反应均无扩增信号，说明反应体系无DNA污染。
样本2的结果见图1B，△Ct＝11.146>9.0，说明不存在EGFR基因T790M突变。
样本3的结果见图1C，△Ct＝7.812<9.0，说明存在EGFR基因T790M突变。
样本4的结果见图1D，△Ct＝5.464<9.0，说明存在EGFR基因T790M突变。
由以上的实验数据可以看出，实验检测结果与实际相符。通过对检测结果△Ct值的计算，可以准确的将EGFR基因T790M突变样品鉴别出来。