一种猪H1N1亚型流感病毒血凝素重组蛋白的制备方法及该病毒抗体的液相芯片检测试剂盒与流程

本发明涉及病毒检测
技术领域：
，更具体地，涉及一种猪H1N1亚型流感病毒血凝素重组蛋白的制备方法及该病毒抗体的液相芯片检测试剂盒。
背景技术：
：猪流感(SwineInfluenza，SI)是猪流感病毒(SwineInfluenzavirus，SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，临床上以突发、咳嗽、高热、呼吸困难、精神沉郁、高发病率、低病死率为特征。目前，全球猪群中以经典猪流感H1N1和类人H3N2亚型为主广泛流行，尽管猪流感死亡率低，但是其可造成其他病原的继发感染，对养殖业造成巨大的经济损失。猪是人、禽流感病毒的易感宿主，是流感病毒跨种传播的中间宿主，是流感病毒基因重组的“混合器”，是引起流感大爆发的重要原因。2009年，甲型H1N1流感病毒(pdm2009)在墨西哥、美国相继爆发，该流行毒株是由人流感、猪流感和禽流感病毒基因自然重组而形成的一种新型流感病毒。该毒株的PB1基因来于H3N2人流感，PA和PB2基因来自于北美禽流感，NA和M基因来自欧亚类禽猪流感，HA、NP和NS基因来自经典猪流感。该毒株能通过抗原的变异逃避机体的免疫系统，短时间内迅速蔓延至全球，造成流感的大流行，而引起人们的关注。在猪场内进行定期的SIV抗体监测对于预防其它疾病的出现，以及在人群中流行具有重要的公共卫生学意义。液相芯片技术又称为Luminex技术、xMAP技术，是美国Luminex公司于20世纪90年代中期开发的一种多功能液相生物芯片检测技术。该技术集流式细胞技术、荧光技术、激光技术、传统的化学技术和计算机处理系统为一体新型多通道高通量生物芯片检测体系，具有高通量、重复性好、快速准确的特点。目前，液相芯片检测技术已被广泛应用于食品生产、医疗保健、环境卫生等领域的微生物检测，在呼吸道、虫媒介等病毒检测、细菌检测、基因检测、药物残留、细胞因子检测等方面广泛应用。2001年12月，美国食品与药物管理局(FDA)批准了用于临床诊断的液相芯片检测技术，该技术是唯一一个被FDA认证了的诊断技术。目前，猪流感病毒抗体诊断方法主要为血凝抑制试验(hemagglutinationinhibitiontest，HI)和微量中和试验(Microtitreneutralizationtest，MIVN)。其中，HI检测方法简单、易操作，但敏感性较差；MIVN检测方法敏感性和特异性好，但操作繁琐、周期长。鉴于此，需要建立一种操作简便、敏感性高、特异性强的方法，对目前进行补充和校对。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，首先提供一种猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法。本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的猪流感病毒的血凝素重组蛋白。本发明的第三个目的是提供所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白作为免疫原在制备检测猪流感病毒的试剂中的应用。本发明的第四个目的是提供一种检测猪流感病毒的试剂盒。本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：S1.去除表达HA基因的信号肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物扩增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S2.连接pMAL-c5X载体，获得pMAL-cHA重组质粒，转入原核表达菌诱导表达即可。SIV的血凝素蛋白(HA)头部包含5个抗原决定簇，是流感病毒的主要表面抗原，可刺激机体产生中和抗体，从而起到保护机体的作用。同时血凝素是流感病毒亚型分类的依据，因此，HA蛋白是开发流感病毒疫苗以及检测方法的首选生物材料。本研究应用生物学软件SignalPV2.0.b2对HA基因进行信号肽分析，去除HA的信号肽。根据HA序列设计一对带有His标签的引物，构建了带有6*His-麦芽糖结合蛋白(MBP)组合标签的原核表达质粒。MBP标签由大肠杆菌K12的malE基因编码，大小约为40KD，在大肠杆菌表达系统中可增加目的蛋白的可溶性；同时，His标签便于重组蛋白的纯化，易于进行之后的实验。前期研究中发现，若去除HA基因的跨膜区，容易影响HA基因表达的抗原的完整性，影响其免疫原性。保留跨膜区也是为了保留HA基因的抗体完整性及其天然构象。使用pMAL-c5X载体的目的是增加目的重组蛋白的可溶性，借以保持其天然空间结构及抗原性。但用于纯化含有MBP标签重组蛋白的Amylose树脂纯化效率较低(即重组蛋白的纯化效率和纯化度低)，因此在上述pMAL-c5X重组质粒的基础上，在HA基因下游引入6*His标签基因。其目的是在后期纯化过程中使用Ni2+纯化填料，提高目的蛋白的纯化效率。最终，本研究构建了带有6*His-MBP组合标签的原核表达质粒pMAL-cHA，成功获得以可溶形式表达的HA重组蛋白。该蛋白能够与H1N1亚型猪流感病毒HA鼠源抗体发生反应，说明了HA重组蛋白具有良好的抗原性，为H1亚型SIV抗体检测方法的建立奠定了基础。优选地，S2所述诱导表达的条件为IPTG0.3mM，温度37℃，时间2小时。因此，本发明还提供所述方法获得的猪流感病毒的血凝素重组蛋白。本发明还提供所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白作为免疫原在制备检测猪流感病毒的试剂中的应用。本发明以液相芯片技术为基础，以SIVH1N1HA重组蛋白为抗原，建立一种猪流感病毒抗体检测新方法。因此，本发明还提供一种检测猪流感病毒的羧基化荧光微球46-HA，是将所述猪流感病毒的血凝素重组蛋白与羧基化荧光微球046(即第46号羧基化荧光微球)偶联获得。具体地，所述的检测猪流感病毒的羧基化荧光微球46-HA的制备方法，包括以下步骤：S1.羧基化荧光微球的活化：将清洗后的羧基化荧光微球046分别依次重悬于磷酸氢二钠缓冲液、Sulfo-NHS溶液和EDC溶液中进行活化；S2.活化后的羧基化荧光微球046悬液中加入猪流感病毒的血凝素重组蛋白进行孵育，并用PBS-TBN重悬即得。本发明还提供一种检测猪流感病毒的试剂盒，所述试剂盒含有所述的猪流感病毒的血凝素重组蛋白，该猪流感病毒的血凝素重组蛋白可用于基于抗原抗体反应原理的免疫反应。优选地，所述试剂盒含有上述羧基化荧光微球46-HA，将偶联好的微球避光保存于4℃，3个月时间内仍然具有很好的稳定性。具体地，针对利用羧基化荧光微球46-HA进行液相芯片检测的技术，所述试剂盒还含有生物标记的鸡抗鼠IgG抗体或者兔抗猪IgG抗体、链霉素-枣红蛋白。更优选地，所述生物标记的鸡抗鼠IgG抗体的稀释度为1：1000，兔抗猪IgG抗体的稀释度为1：5000，链霉素-藻红蛋白的稀释度为1：1000。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首先提供了猪流感病毒的血凝素重组蛋白的制备方法，通过去除HA的信号肽。根据HA序列设计一对带有HIS标签的引物，构建了带有6*His-麦芽糖结合蛋白(MBP)组合标签的原核表达质粒。在大肠杆菌表达系统中成功获得以可溶形式表达的HA重组蛋白。该蛋白能够与H1N1亚型猪流感病毒HA鼠源抗体发生反应，说明了HA重组蛋白具有良好的抗原性，利用该凝素重组蛋白建立液相芯片检测技术，灵敏度比ELISA高，该方法的建立，将为开展猪流感病毒抗体的检测提供必要的技术补充，为其它疫病抗体液相芯片检测技术的研究奠定技术基础，为多种猪病抗体多重液相芯片检测技术的建立提供试验依据。附图说明图1为HA基因的PCR扩增结果，其中，M：DL-2000标准分子量；1：样品的PCR扩增产物。图2为重组质粒pMAL-cHA酶切鉴定，其中，M：DL-2000标准分子量；1为重组质粒双酶切PCR扩增产物。图3为HA重组蛋白表达结果，其中，M：DL-2000标准分子量；1：pMAL-c5X空载体诱导前；2：pMAL-c5X空载体诱导后；3：重组质粒pMAL-cHA诱导前；4.重组质粒pMAL-cHA诱导后。图4为HA重组蛋白可溶性分析结果，其中，M：DL-2000标准分子量；1：pMAL-c5X空载体诱导后；2：重组质粒pMAL-cHA诱导前；3：重组质粒pMAL-cHA诱导后；4：菌液超声破碎上清；5：菌液超声破碎沉淀。图5为HA重组蛋白的WesternBlot分析，其中，M：DL-2000标准分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA诱导后；2：Rosetta-pMAL-cHA诱导前。图6为HA蛋白的纯化SDS-PAGE分析，其中，M：DL-2000标准分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA纯化前；2：Rosetta-pMAL-cHA纯化后。图7为偶联和检测方法可行性的验证结果。图8为单抗稀释梯度的检测结果。图9为血清稀释梯度检测结果。图10为检测方法的特异性分析。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1表达质粒的构建一、流感病毒总RNA的抽提与cDNA的合成参考RNA抽提试剂盒说明书进行病毒总RNA的提取。获得总RNA后参照宝生物工程(大连)有限公司的M-MLV反转录酶的使用说明书进行反转录操作，反应体系如表1。表1反转录体系试剂名称体积RNA9.5μL5×MLVBuffer4.0μLMLV反转录酶1.0μLdNTPs(2.5mmoleach)4.0μLRNaseInhibitor(20U/μL)0.5μL反转录引物1.0μL总计20μL表1中的各试剂加入后充分混匀，于42℃水浴锅中放置1h，获得cDNA产物置于-20℃冻存备用。二、SIVH1N1HA基因的扩增应用Oligo7.0生物学软件，根据SIVH1N1HA基因序列(GenBank：JN375120.1，去除表达信号肽部分的核苷酸序列)设计一对特异性引物，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，上、下游引物加入酶切位点，且下游引物加入His标签，引物序列为：HA-F：5’-TTGCGGCCGCGACACATTATGTATAGG-3’(NotI)；HA-R：5’-GCGTCGACATGATGATGATGATGATGAATACATATTCTACACTG-3’(SalI)；下划线部分为引物的限制性酶切位点，限制性酶切位点名称在引物后括号内显示；下游引物中斜体部分为表达6×His基因序列；HA基因扩增片段长度为1,683bp。SIVH1N1HA基因的扩增反应体系如下：10×TaqBuffer2.5μL、ExTaqDNA聚合酶0.25μL、HA-F0.5μL、HA-R0.5μL、模板1μL、ddH2O20.25μL；反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火温度为55℃30s，72℃延伸2min，共30个循环，72℃终延伸7min，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1，HA基因片段大小与预期相符，目的片段长度为1683bp。(图1)。三、连接、转化与鉴定应用DNA胶回收试剂盒对首轮PCR产物进行回收，连接pMD-18T载体，转化感受态细胞，挑取单克隆菌落培养过夜，抽提质粒并进行PCR的初步鉴定，将阳性质粒送至上海生工进行测序鉴定，阳性质粒命名为pMD-SIVHA。将重组质粒pMD-SIVHA进行NotI和SalI限制性内切酶的双酶切，回收目的基因片段；同时对pMAL-c5X载体进行NotI和SalI双酶切，回收酶切载体片段。利用T4连接酶将HA与pMAL-c5X载体双酶切片段进行连接，经转化，鉴定结果如图2，重组质粒pMAL-cHA测序结果与目的基因的序列一致，证明重组质粒构建成功，即获得pMAL-cHA重组质粒。实施例2重组蛋白的表达、纯化与鉴定将含有重组质粒pMAL-cHA的Rosetta(DE3)大肠杆菌接种至Luria-Bertani(LB)液体培养液中，培养物OD值达0.6时加入终浓度为0.3mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃培养2小时后，收集产物进行SDS-PAGE检测；应用Westernblot方法，以抗SIVHA单抗为一抗，对表达产物进行检测。同时离心收集菌体，冰浴超声破碎，再次离心后，沉淀物和上清液分别进行SDS-PAGE检测，分析表达产物的溶解性。HA目的蛋白大小与预期相符，在约100KD处有一条目的条带(图3)，且目的蛋白在上清和沉淀中均有表达，说明该蛋白具有可溶性(图4)。IPTG诱导表达后的菌液经SDS-PAGE电泳后转至NC膜上，HA蛋白分别与各自单抗孵育，进行Western-blot分析，结果显示HA蛋白与其单抗均可发生特异性反应，产生单一条带(图5)。说明了表达的目的蛋白具有抗原性，可用于基于抗原抗体反应的检测技术的建立。一、重组蛋白的纯化超声破碎后的上清液经滤器(0.45μm)过滤，用GE填料填充的Ni2+亲和层析柱过柱纯化。主要操作步骤如下：放掉纯化柱中20％乙醇溶液，用6倍柱体积的去离子水冲洗层析柱；用5～10倍柱体积的20mM咪唑缓冲液过柱，流速保持为每滴6s，平衡柱子；将上清液过柱，保持流速每滴6s，上清液重复过柱3遍；用10倍柱体积的20mM、80mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，保持流速每滴6s；最后用500mM咪唑洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，保持流速每滴6s，每管收集1mL洗脱液。用分光光度计测定分段收集的目的蛋白的浓度并做SDS-PAGE进行纯度分析，纯化后的HA蛋白经SDS-PAGE分析结果如图6。实施例3应用Rosetta-pMAL-cHA建立液相芯片检测方法一、抗原与微球的偶联参照Luminex公司的技术大全，两步酰胺反应：首先磷酸化微球经磷酸氢二钠缓冲液、Sulfo-NHS和EDC溶液成为活化状态，其次利用实施例2制备得到的HA重组蛋白作为抗原与微球形成共价酰胺键，偶联上抗原的微球用PBS-TBN溶液重悬于4℃避光保存。具体操作步骤如下：(1)漩涡仪振荡微球悬液1min，使微球均匀散开；(2)取微球100μL转移到1.5mL离心管中，8000g/min，2min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清(不要吸走微球)；(3)加入100μLddH2O，涡旋1min，再8000g/min，2min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清(不要吸走微球)；(4)加入80μL100mM、pH＝6.2的磷酸二氢钠盐溶液(NaH2PO4)，涡旋1min，重悬微球；(5)加入10μL、50mg/mL的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-Hydroxysulfosuccinimiesodiumsalt-Sulfo-NHS，N-Sulfo-NHS)，和10μL50mg/mL1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺[1-thyl-3-(3-Dimethylaminoproy)carbodimideHydrochloride，EDC]，涡旋1min。(6)室温孵育20min(每隔10min用漩涡仪轻振)，8000g/min，2min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清；(7)加入250μL50mM、pH＝5.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(2-(N-Moropholino)ethanesulfonicacid，MES)，涡旋1min，并放于磁力架上，轻轻移走上清；(8)重复步骤(7)一次；(9)将上述活化后的微球中加入100μL50mM、pH＝5.0的MES，涡旋1min，在混匀的磁珠中加入10μg的HA重组蛋白抗原，再用MES定容至500μL，涡旋1min；(10)在室温下放在摇床上孵育2h，8000g/min，2～3min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清；(11)涡旋1min，再在摇床上孵育30min，8000g/min，2～3min离心，并放于磁力架上，轻轻移走上清；(12)再加入1mLPBS-TBN，8000g/min，2～3min离心，沉淀微球，弃上清，再重复一次；(13)加入1mLPBS-TBN，重悬微球，即得偶联抗原的微球：46-HA(即第46号微球与HA重组蛋白偶联)，并4℃避光保存。二、样品上机检测参照Luminex公司的技术大全，具体步骤如下：(1)每孔加入50μL(2500个)偶联有抗原的微球和50μL待检测样品(单抗或血清)，室温震荡(500r/min)避光孵育1h，用PBST洗涤2次，200μL/孔；(2)加入生物素标记的鸡抗鼠(1：1000)或兔抗猪(1：5000)IgG抗体100μL/孔，室温震荡(500r/min)避光孵育1h，用PBST洗涤2次，200μL/孔；(3)加入1：1000稀释的链霉素-藻红蛋白(SA-PE)100μL/孔，室温震荡(500r/min)避光孵育0.5h，用PBST洗涤2次，200μL/孔；(4)每孔加入125μL鞘液重悬，于Flex3D液相芯片检测系统读取中位数荧光强度(MFI)。三、偶联效率的评价HA蛋白与46号微球偶联，用偶联有抗原的微球对SIV阳性血清、SIV阴性血清、PBS进行检测，结果表明阳性血清的MFI(meanfluorescenceintensities)大于10000，且大于5倍阴性对照的MFI，空白对照的MFI小于100(图7)，且大于5倍阴性对照的MFI，空白对照的MFI小于100(图7)，说明该偶联方法和检测方法是可行的。将HA单抗从初始浓度14.6ug/mL进行2倍梯度稀释，用液相蛋白芯片检测方法检测，MFI值采用SPSS软件进行拟合三次方程。结果表明，SIV液相蛋白芯片检测方法的相关系数(R2)为0.997，说明了曲线相关性好(图8)。同时，当单抗浓度低至1ng/mL时，该方法仍具有高灵敏度(图8)。四、血清稀最佳释度的确定SIV阳性血清、SIV阴性血清用PBS-1％BSA进行梯度稀释：1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600，每个稀释度3个重复，以确定血清最佳稀释倍数。检测结果显示血清的最佳稀释倍数为1：200，当血清稀释至1：1600时，阳性血清的MFI大于临界值，仍可检测出阳性(图9)。本研究建立的液相蛋白芯片检测方法具有较高的灵敏度，当血清稀释至1：1600，检测结果仍为阳性。此外，MFI值随着血清浓度稀释呈先升高后降低的趋势。五、特异性试验利用上述液相蛋白技术芯片检测方法对猪常见疾病PRRSV、SIV、HEV、CSFV、PCV-2、PRV、FMDV阳性血清进行检测，以验证该检测方法的特异性。结果显示：应用SIV液相蛋白检测方法时，只有SIV阳性血清检测结果为阳性，其他疾病阳性血清检测结果为阴性(图10)。说明本研究建立的液相蛋白芯片检测方法特异性好，与其它病毒阳性血清无交叉反应。六、重复性试验批内重复：取HEV4份阳性血清、1份阴性血清，每份血清10个重复，通过计算其变异系数以评价该方法的批内精密度。批间重复：取HEV11份阳性血清、1份阴性血清，每份血清3个重复，不同时间做3次，通过计算变异系数以评价该方法的批间精密度。SIV液相蛋白芯片检测方法的批内变异系数(CV)为4.4～7.8％(表2)，批间变异系数为：2～10.6％(表3)。其平均批内变异系数为：6.2％，平均批间变异系数为：6.5％(表4)；符合Luminex精密度的要求：批内CV为不大于10％，批间CV不大于20％，说明该检测方法具有良好的重复性。表2SIV液相蛋白芯片检测方法批内重复试验表3SIV液相蛋白芯片检测方法批间重复试验表4平均批内、批间变异系数批内(CV％)批间(CV％)SIV4.4～7.8(6.2)2～10.6(6.5)七、液相蛋白芯片与ELISA的比较采用上述液相芯片检测方法和ELISA同时检测临床血清，SIV110份，通过MedCalc软件进行ROC分析，确定最优临界值、灵敏度、特异性。同时通过配对卡方检验(关联卡方检验，优势卡方检验)评价其符合率。结果显示，SIV液相蛋白芯片检测技术的灵敏度为96.6％，特异性为93.8％，临界值为6511(表5)。表5液相蛋白芯片检测方法ROC分析结果灵敏度(％)特异性(％)临界值SIV96.693.86511关联性卡方检验结果：SIV液相蛋白芯片法与ELISA检测结果差异不显著，具有一致性，能反映同一指标(表6)，液相蛋白芯片和ELISA试剂盒对110份临床血清样品的检测SIV阳性率分别为30.9％、26.4％，液相蛋白芯片检测方法的灵敏度比ELISA高，与预期相符。表6MFIA与ELISA关联卡方检验结果SEQUENCELISTING<110>华南农业大学<120>一种猪H1N1的血凝素重组蛋白的制备方法及其血凝素重组蛋白和检测试剂盒<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>HA-F<400>1ttgcggccgcgacacattatgtatagg27<210>2<211>44<212>DNA<213>HA-R<400>2gcgtcgacatgatgatgatgatgatgaatacatattctacactg44当前第1页1 2 3