菊苣酸在促进神经干细胞增殖及诱导分化中的应用及其药物应用的制作方法

本发明涉及神经性疾病的防治领域，更特别地，涉及菊苣酸在促进神经干细胞增殖和分化中的应用及其药物应用、菊苣酸在制备预防神经退行性疾病的药物中的应用，以及一种用于预防神经退行性疾病的药物组合物。

背景技术：

神经干细胞(neural stem cell,NSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等细胞群。NSCs在胚胎脑中广泛分布，如大脑皮质、脑室下区、室管膜上皮等，成体NSCs主要分布在海马齿状回颗粒下层和室管膜下区。有研究表明，NSCs对胚胎期神经系统的发育以及出生后神经组织的再生和修复有重要作用。

在人类和其他脊椎动物的衰老或疾病的过程中，神经干细胞的自我更新和分化能力减弱，神经元在损伤甚至死亡后，没有相应的神经干细胞分化成神经元来修复损伤的神经组织。神经元死亡是神经退行性疾病的中心事件，如在阿尔茨海默症(Alzheimer’sdisease，AD)，帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)，亨庭顿氏病(Huntington’s disease，HD)或多发性硬化(multiple sclerosis，MS)等。这些不同种疾病有一些相同的特点，如选择性的神经元进行性退行，不断严重的神经炎症反应，损伤的氧化代谢，以及未折叠蛋白/错误折叠蛋白的积累等。

因此，需要一种药物刺激人体内神经干细胞的增殖和分化成神经元，使得具有患神经退行性疾病风险的人或动物体内的神经干细胞加速增殖并分化成神经元，以替代受损或死亡的神经元，从而预防神经退行性疾病的发生或延长神经退行性疾病的潜伏期。

菊苣酸(Cichoric acid)，又称二咖啡酰酒石酸，是由单咖啡酰酒石酸和咖啡酸组合而成，是一种咖啡酸衍生物。菊苣酸主要存在于菊苣、紫锥菊、白头翁和问荆中。

菊苣酸的化学结构式如下：

分子式：C₂₂H₁₈O₁₂

分子量：474.37

菊苣酸是极为重要的免疫活性成分之一。近年来的药理研究表明，菊苣酸具有抗病毒，抑制HIV-1和HIV-2整合酶的作用、抗癌、抗真菌，增强免疫功能和抗炎作用，并能抑制透明质酸酶，保护胶原蛋白免受可导致降解的自由基的影响。

然而迄今未见国内外发表菊苣酸促进神经干细胞增殖并由此得到具有分化成神经元潜能的神经干细胞球方面的研究报道，也尚未见到使用菊苣酸诱导神经干细胞分化成神经元的研究报道。相应的，菊苣酸在制备预防神经退行性疾病的药物中的应用也未见报道。

技术实现要素：

为解决以上技术问题，本发明提供了菊苣酸在促进神经干细胞增殖及诱导分化中的用途。

本发明还提供了菊苣酸在制备预防神经退行性疾病的药物中的应用。

进一步地，所述神经退行性疾病为帕金森氏病、老年性痴呆、亨廷顿氏病或多发性硬化。

本发明还提供了一种用于预防神经退行性疾病的药物组合物，其包含菊苣酸或其药学可接受的盐。

优选地，所述药物组合物为经口施用剂型或经静脉注射剂型。

进一步地，所述药物组合物还包含药学可接受的载剂。

通过使用本发明的菊苣酸的应用和包含菊苣酸的药物组合物，可有效预防例如帕金森氏病、老年性痴呆、亨廷顿氏病或多发性硬化等神经退行性疾病的发生，降低中老年人患老年性疾病的风险。

附图说明

图1为菊苣酸诱导5天后E13.5天小鼠大脑皮质NSCs形成的神经干细胞球的显微照片；

图2为菊苣酸处理后神经干细胞球的数量变化柱状统计图；

图3为MTT法检测菊苣酸处理后NSCs的增殖曲线；

图4为菊苣酸处理后NSCs细胞周期时分布曲线；

图5为菊苣酸处理后NSCs的G0/G1和G2/S期细胞百分比柱状统计图；

图6为菊苣酸诱导增殖后贴壁的神经干细胞球的nestin免疫荧光阳性染色照片；

图7为菊苣酸诱导5天分化的贴壁神经干细胞球经tubulin(红色)和Hoechest 33258(蓝色)双染色照片；

图8为菊苣酸诱导1和3天后分化的贴壁神经干细胞球的tubulin染色照片；

图9为贴壁1天和3天后神经干细胞球突起长度的柱状统计图；

图10为贴壁后1天和5天后神经干细胞球相关基因的表达的RT-PCR结果，泳道M：250和100bp DNA ladder marker；泳道1和5：GADPH；泳道2和6：Tau；泳道3和7：GFAP；泳道4和8：nestin；泳道1-4：对照组；泳道5-8：菊苣酸实验组；

图11为MPTP注射后小鼠的症状恢复时间统计图；

图12为爬杆实验中各组小鼠爬杆所需时间统计图；

图13为水迷宫实验中各组小鼠的寻找潜伏期统计图；

图14为大鼠在转轴上的停留时间统计图；

图15为小鼠Weaver’s 15分法评分统计图。

具体实施方式

以下结合实例和附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

体外实验：

1.胎鼠神经干细胞的体外分离和培养

为获取多向分化潜能的神经干细胞，取怀孕(E)13.5天的昆明小鼠分离胚胎，Krebs液(100mmol/L NaCl，2mmol/L KCl，0.6mmol/L KH₂PO₄，12mmol/L NaHCO₃，7mmol/L葡萄糖，0.1％酚磺酞，0.3％牛血清白蛋白和0.3％硫酸镁)内分离大脑皮质，机械粉碎组织，离心后重悬细胞，制成单细胞悬液。

2.获得神经干细胞球

将所述单细胞悬液分成四组，三个实验组分别接种于包含5、20、40μg/mL菊苣酸的DMEM/F12(1：1)培养基(含2％的B27和20ng/mL的bFGF)的培养板中，37℃，5％CO₂条件下培养，对照组中不添加菊苣酸，形成神经干细胞球。

用菊苣酸处理5天，均可获得较多数量的NSCs，形成的神经干细胞球不仅数量多，而且体积较大(图1)。计数单细胞悬液传代的次代神经干细胞球的数量显示，用菊苣酸干预后形成的神经干细胞球在数量上明显多于对照组(对照组为(25.46±6.21))个，菊苣酸实验组：5μg/mL为(45.54±4.53)个，20μg/mL为(85.38±14.12)个，40μg/mL为(102.39±8.5)个)(图2))。结果显示，在体外，菊苣酸具有促进NSCs增殖和自我复制的作用。

3.神经干细胞球的传代

神经干细胞球每7天用机械分离的方法传代。神经干细胞球被机械分离成单细胞悬液后，取适量的细胞悬液进行台盼蓝染色，按照试剂盒说明书的步骤在细胞计数器上计数细胞的密度并检测其活力。然后按照6×10⁵的密度接种于培养板，用DMEM/F12(1：1)培养基(含2％的B27和20ng/mL的bFGF)，37℃，5％CO₂条件下培养，接种细胞24h后形成神经干细胞球，之后每隔4天半量换液。实验中用原代神经干细胞球观察细胞的增殖和分化。

4.MTT检测

细胞分为实验组和对照组用于增殖实验检测。NSCs用DMEM/F12(1：1)培养基(含2％的B27和20ng/mL的bFGF)，37℃，5％CO₂条件下培养共7天，对照组不加菊苣酸；实验组细胞亦培养7天，但在培养基中加不同浓度的菊苣酸(0，1，5，10，20，40，80μg/mL)。用MTT法检测NSCs的增殖和活力，所得数据绘制成生长曲线。机械分离获得NSCs后取200μL的细胞悬液，接种于96孔板，设5个复孔。置37℃，5％CO₂条件下培养24h。之后每孔加20μL MTT溶液(5mg/mL)再行培养4h。离心后小心吸去上清液，每孔加150μL DMSO溶解蓝色结晶。用酶标仪干涉波长655nm下读取490nm波长处的A值。

对照组细胞仅增多2倍，与之相比，菊苣酸处理后的NSCs在各个时间点增殖程度均表现出明显增高，1-4天，NSCs的增殖呈逐渐增多的趋势，4天后，不同浓度的菊苣酸干预后增殖水平均呈现相对稳定的状态。然而在所设定的时间段内，40和20μg/mL的菊苣酸对NSCs增殖作用的程度相似，且均明显强于5μg/mL菊苣酸实验组和对照组(图3)。

5.细胞周期检测

用流式细胞术检测细胞周期时相。按照1×10⁶/孔的密度接种NSCs，加菊苣酸(20μg/mL)后培养，设5个复孔。培养5天后，用PBS漂洗细胞，4℃的100％酒精固定24h，加10μL RNase A(10mg/mL)后，37℃孵育30min。10mg/mL PI(含100mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂和0.1％Triton X-100，pH 6.8)染色，PI与细胞DNA结合后用红外光激发荧光。用流式细胞仪附带的ModFIT软件分析DNA的含量，获得G0/G1和G2/S期细胞的定量数据。

菊苣酸诱导后G2/S期细胞明显增多(对照组：(14.4±3.53)％；菊苣酸实验组：5μg/mL为(20.6±0.48)％，20μg/mL为(35.8±1.38)％，40μg/mL为(41.2±1.7％))，同时伴随G0/G1期细胞数量减少(对照组：(87.6±1.97)％；菊苣酸5μg/mL为(82.8±0.43)％，20μg/mL为(67.6±1.35)％，40μg/mL为(62.6±1.26)％(图4)。G0/G1和G2/S细胞的比例用直方图显示(图5)。

6.菊苣酸诱导后得到的神经干细胞球的干细胞特性

诱导分化前，确定神经干细胞球在菊苣酸诱导增殖后是否仍然表现出其干细胞特性是一个重要环节。当神经干细胞球完全形成并贴壁后，用免疫荧光染色方法分别检测nestin蛋白的表达。用20μg/mL菊苣酸诱导增殖后，形成的神经干细胞球nestin免疫荧光阳性(图6)，显示其仍然表达nestin，具有NSCs特性。

7.菊苣酸诱导贴壁神经干细胞球分化成神经元

使菊苣酸诱导增殖的神经干细胞球用菊苣酸(20μg/mL)诱导分化，细胞贴壁后分别培养1，3和5天。

8.菊苣酸诱导对神经干细胞球分化成神经元的影响

贴壁神经干细胞球继续培养至5天后，用tubulin抗体进行免疫荧光染色，并用Hoechst 33258复染胞核，计数阳性细胞及其百分比。有趣的是，当在培养基中加入菊苣酸后，神经干细胞球分化出较多的神经元，神经元所占的比例提高(对照组：28.7±6.42，20μg/mL菊苣酸实验组：63.4±7.59)(图7)，而胶质细胞的数量相对减少。结果显示，当在培养基中加入菊苣酸诱导后促进了神经干细胞球分化出较多的神经元。

9.菊苣酸对NSCs突起生长的作用

为探讨菊苣酸对NSCs分化的作用，检测了NSCs分化为神经元和其他细胞的能力。首先分离次代神经干细胞球并接种于预先放置盖玻片的培养板内，贴壁后用20μg/mL的菊苣酸处理1和3天后观察。培养1天，与对照组比较，虽然神经干细胞球内细胞有大量的突起从神经干细胞球的边缘伸出，但仅见少量的神经元完全从神经干细胞球迁移出来。免疫荧光染色(图8)显示，这些迁出的细胞和神经干细胞球伸出的突起已表达成熟神经元标志性蛋白tubulin；培养3天后，较多的神经元从神经干细胞球迁出，而且显示出神经元的特征，tubulin免疫荧光染色阳性；与对照组比较，可见长且密集的突起从神经干细胞球的边缘伸出。

用突起生长定量分析试剂盒对突起进行定量分析，按照说明书的步骤进行检测。测定前首先用多聚-L-赖氨酸包被微孔滤膜，然后按照1×10⁴/孔的密度把100μL的单细胞悬液接种于12孔板内微孔滤膜上(上室)。细胞分为对照组和实验组，实验组细胞于培养基中加菊苣酸(20μg/mL)培养7天诱导突起生长和细胞分化，设5个复孔。之后取出上室，PBS漂洗，用4℃的100％甲醇室温下固定20min。后进入含500μL突起染液的下室室温下染色15min，漂洗后用棉签拭去微孔滤膜上面的胞体。置200μL的突起提取液于切割成小片的封口膜上，把微孔滤膜的下面置于突起提取液中，室温下孵育5min。分光光度计562nm波长下测定突起提取液的A值。

突起提取液的A值较对照组明显升高(对照组：1天为0.424±0.059，3天为1.071±0.127；菊苣酸实验组：1天为1.547±0.235，3天为1.923±0.074)(图9)。

10.RT-PCR法检测神经干细胞球及其分化后(1和5天)相关基因的表达

按照试剂说明书步骤用Trizol提取NSCs的总RNA，紫外分光光度仪测260nm光吸收值和260-280nm比值进行RNA含量和质量检验。取1mg的总RNA用Oligo dT和AMV进行逆转录。

nestin mRNA的上游引物：5’-GAGAAGACATGAGGCAGATAAGTTA-3’，下游引物：5’-GCCTGTGTTCTCCAGCTTGCT-3’；

tau mRNA的上游引物：5’-GCCTGAAGGCTATCCAATAC-3’，下游引物：5’-CAGGTCCCAAGTGTCAATAA-3’；

GFAP mRNA的上游引物：5’-GAGAAGACATGAGGCAGATAAGTTA-3’，下游引物：5’-GCCTGTGTTCTCCAGCTTGCT-3’；

GAPDH的上游引物：5’-GAGAAGTGGTAGGTCTAAGTTTG-3’，下游引物：5’-GCCGCTCTAGGGACTCGTT-3’；

2μg RNA逆转录的cDNA以25μL为反应体系，30个循环进行PCR，循环反应条件94℃，30s；55℃，45s；72℃，1min。后终末延伸72℃，5min。用1％琼脂糖凝胶电泳分离并分析PCR产物。

通过电泳条带的分析，证实菊苣酸诱导分化开始时，tau、GFAP和nestin mRNA均有表达。定量分析结果显示(图10)，与对照组比较各基因的灰度无明显差异，对照组tau，GFAP和nestin mRNA分别为0.326±0.021，0.414±0.074和1.031±0.023；20μg/mL菊苣酸实验组分别为0.421±0.022，0.436±0.026和0.956±0.017。菊苣酸诱导分化后，对照组细胞表达TaumRNA和GFAP mRNA，A值分别为0.577±0.029和0.628±0.025，未检测到nestin mRNA表达。与对照组相比，菊苣酸处理后分化的神经干细胞球高水平表达tau mRNA，GFAP mRNA表达水平较低，A值分别为0.814±0.021和0.423±0.059，未检出nestin mRNA表达。

通过以上实验，证明了菊苣酸可在体外促进神经干细胞的增殖，以及促使神经干细胞分化成神经元。因此，发明人猜测菊苣酸可能有助于预防神经退行性疾病。在下文中，我们将通过一些动物神经退行性疾病模型来观察菊苣酸是否在神经退行性疾病的预防中起作用。

动物实验：

1.小鼠帕金森氏病模型

发明人采用MPTP发来制造小鼠帕金森氏病模型，步骤如下：给小鼠注射25mg/kg MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)，每周两次，连续注射5周。

将小鼠随机分成3组(对照组、造模组和给药组)，每组20只，其中对照组将施用的MPTP替换成生理盐水；造模组按造模步骤处理；给药组在除了执行造模组的步骤外，还从注射MPTP前10天开始隔天施用一次菊苣酸，持续2个月，通过灌胃施用，施用剂量为80mg/kg。

造模期间的行为观察：在每次注射完MPTP后半个小时左右，造模组和给药组的小鼠出现震颤、前腿抬高、竖尾、竖毛，随后出现短暂性的活动减少、对外界刺激反应低下等类帕金森症状，一开始这些症状是可恢复的。但是，随着造模时间的推移，造模组的小鼠恢复所需要的时间越来越长，最后一次注射后小鼠的症状至数月后才有所恢复，所有造模组小鼠都成功建立了帕金森氏病模型，而给药组的恢复所需时间延长没有造模组那么严重(图11)，仅有两只给药组小鼠在MPTP处理结束后表现出长期的帕金森症状。

经MPTP处理后，将小鼠继续培养6个月，定期对小鼠进行爬杆实验。结果显示，随着培养时间的推移，对照组小鼠的爬杆时间稳定保持在4-6s，造模组小鼠爬杆时间逐渐加长，到培养结束时，需要14-18s的时间，给药组小鼠的爬杆时间随着培养的推移一开始也略有加长，但到后期稳定在8-12s(图12)。培养期间，分别在第30、60、90、120、150、180天时每组各取一只小鼠处死，通过病理学检测。

培养6个月后，处死剩余小鼠，进行病理学检测。通过HE染色可知，与对照组相比，造模组的神经细胞在培养的开始阶段迅速缺失，随着培养时间的推移，到5个月后方有所减轻，给药组神经细胞开始时亦有缺失，但是程度比造模组减轻很多，并且在第90天时，神经细胞的缺失就有减轻趋势。

中脑黑质纹状区的酪氨酸羟化酶(TH)染色结果显示，造模组在处理完后TH阳性细胞即开始减少，并且随着培养时间的推移减少加剧，给药组小鼠的TH阳性细胞在培养初期也减少，但是程度比造模组轻很多，并且从第120天开始趋势减缓。

由此可见，用菊苣酸灌胃小鼠，有助于小鼠的神经损伤恢复，从而预防帕金森氏病的发生。

2.小鼠老年性痴呆模型

发明人采用腹腔注射120mg/kg D-半乳糖和90mg/kg亚硝酸钠，持续60天来制造小鼠老年性痴呆模型。

将小鼠随机分成3组(对照组、造模组和给药组)，每组20只，其中对照组将施用的D-半乳糖和亚硝酸钠替换成生理盐水；造模组按造模步骤处理；给药组在除了执行造模组的步骤外，还从注射D-半乳糖和90mg/kg亚硝酸钠前10天开始隔天施用一次菊苣酸，持续2个月，通过尾静脉注射施用，施用剂量为30mg/kg。

处理期间观察小鼠的行为表现。从注射D-半乳糖和亚硝酸钠算起第35天造模组小鼠出现第一只小鼠发生触须脱落，至第40天，造模组的每只小鼠都发生触须脱落。给药组小鼠到第55天才出现第一例脱落胡须的小鼠，到第60天总共有3只小鼠脱落胡须。

颊部皮肤组织切片显示,对照组小鼠触须的毛囊饱满、圆整,内部结构层次丰富,被毛排列致密整齐；而在造模组小鼠的毛囊则出现萎缩、塌陷,由于触须的脱落,毛囊内出现明显的空洞,被毛排列稀疏、不规则。给药组仅有3只小鼠出现触须脱落，其他小鼠毛囊和毛色保持基本完好。

造模完毕后，造模组小鼠都呈现出老年性痴呆的症状。对小鼠进行水迷宫实验，实验方法如下：自动记录水迷宫装置为80cm×50cm×20cm的茶色有机玻璃槽,内设起点、终点(台阶)和多处盲端,水深9cm,水温24℃～27℃,记录小鼠从起始点放入至找到台阶的时间(寻找潜伏期),若超过120s则以120s计。给药完毕后第1天,各组小鼠进行训练,使其找到台阶；第2-5天加长路程,记录各组小鼠的寻找潜伏期。

结果如图13所示，与对照组相比，造模组小鼠的记忆力明显衰退，而给药组的记忆力比对照组略差，但是仍然显著强于造模组。

通过病理学检测显示，对照组和大多数给药组小鼠的海马和皮层神经细胞染色均一、结构完整,细胞膜、核膜清晰。造模组小鼠的海马可见明显散在的或连续的神经细胞变性坏死,表现为胞浆深染、核固缩、胞膜核膜界限不清晰；严重的出现点状中断,在大脑皮层也可见较多变性坏死的神经细胞。偶尔可见类老年斑结构。

由此可见，用菊苣酸灌胃小鼠，有助于小鼠的神经损伤恢复，从而预防老年性痴呆的发生。

3.大鼠亨廷顿氏病模型

亨廷顿氏病(HD)是一种以神经系统退行性改变为主要特征的常染色体显性遗传病。本发明通过腹腔注射三硝基丙酸来建立大鼠亨廷顿氏病模型。步骤如下：给大鼠连续两天注射15mg/kg三硝基丙酸，间隔两天后连续三天注射15mg/kg三硝基丙酸。

将大鼠随机分成3组(对照组、造模组和给药组)，每组20只，其中对照组将施用的三硝基丙酸替换成生理盐水；造模组按造模步骤处理；给药组先隔天施用一次菊苣酸，持续一个月，通过灌胃施用，施用剂量为80mg/kg。然后再执行造模组的处理步骤。

造模结束后，将三组大鼠置于直径6.985cm的转轴上，转轴的旋转速度为15r/min，观察最大旋转时间为100s，记录大鼠在转轴上停留的时间。如图14可知，对照组大鼠一直能保持在100s以上，造模组大鼠从造模处理之后第二天开始停留时间快速减少，第4-6天几乎无法在转轴上停留，之后才有逐渐改善。给药组大鼠在第3-5停留时间有所减少，随后恢复，并在第7天的停留时间超过100s。

由此可见，用菊苣酸灌胃大鼠，有助于大鼠的神经损伤恢复，从而预防和治疗亨廷顿氏病的发生。

4.小鼠EAE模型

多发性硬化是中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病的代表。实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的临床表现及病理改变与急性多发性硬化极其相似，因而成为研究多发性硬化的免疫病理学机制及其实验性治疗的最佳动物模型。

本实施例中以下方法来进行小鼠EAE造模：将100μL 2mg/mL的MOG_33-35(多肽，序列为：MEVGYRSPFSRVVHLYRNGK)和100μL弗氏完全佐剂混合制成乳剂，进行多点皮下注射免疫，并且同时腹腔注射百日咳毒素(300ng/只)，两天后再注射一次百日咳毒素，第一次注射起的7天后再进行一次免疫。

将小鼠随机分成3组(对照组、造模组和给药组)，每组20只，其中对照组将施用的D-半乳糖和亚硝酸钠替换成生理盐水；造模组按造模步骤处理；给药组隔天施用一次菊苣酸，持续1个月，通过尾静脉注射施用，施用剂量为30mg/kg，然后再执行造模组的处理。

造模处理结束后，使用Weaver’s 15分法来评价小鼠的症状。其评分方法为：对于尾巴，0分表示无症状，1分表示尾巴半瘫，2分表示尾巴全瘫；对于四肢，0分表示无症状，1分表示无力或步态改变，2分表示肢体轻瘫，3分表示肢体全瘫，将尾巴得分和四肢得分乘4后相加即为总分，死亡为15分。结果如图15所示，造模组小鼠在造模处理后表现出明显的尾巴和四肢机能障碍。而给药组在在造模处理后症状较轻，并且后期恢复也较快。

可见用菊苣酸灌胃大鼠，有助于大鼠的神经损伤恢复，从而预防EAE，由此可推测菊苣酸对多发性硬化有预防作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。