一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系及应用的制作方法

本发明属于精原干细胞培养技术领域，具体涉及一种无生长因子添加的精原干细胞培养体系及其应用，特别涉及一种高效表达重组生长因子GDNF的STO滋养层细胞和成分明确的精原干细胞培养基。

背景技术：

精原干细胞是位于雄性哺乳动物睾丸曲细精管基底膜上的生殖干细胞。它在整个睾丸的生殖细胞中只占0.02％～0.03％，但却是唯一的生殖干细胞，可以进行自我更新和分化，维持整个雄性动物生命过程中的精子发生。精原干细胞的分离培养对于研究精原干细胞的增殖和体外分化及精子发生的机制都起着非常重要的作用。早在2003年已经有一些实验室可以在体外培养精原干细胞较长时间，其中比较有代表性的是Brinster RL和Shinohara T实验室。Brinster实验室采用小鼠囊胚上皮细胞(STO)为滋养层细胞而Shinohara实验室采用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为滋养层细胞。这两种培养方法都需要添加复杂的生长因子，包括：神经胶质源性生长因子(GDNF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)，神经胶质源性生长因子受体-α1(GFRα-1)，重组白血病抑制因子(LIF)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，重组干细胞因子(SCF)等。这些重组生长因子价格昂贵，且需要持续添加，培养成本十分昂贵(尽管只有GDNF是目前公认的必须生长因子)，精原干细胞的增殖缓慢，平均倍增期在一周左右，使得培养操作也变得十分繁琐复杂。此外以往有文献报道需要血清支持精原干细胞的培养工作，血清的成分极其复杂，所包含的各成分对细胞生长的作用也不明确，且培养的细胞易分化，不支持体外长期培养。为解决上述问题，我们发明了一个简单高效的体系，将GDNF基因转入STO细胞使其高效表达GDNF蛋白，用这种高效表达GDNF蛋白的STO细胞作为滋养层，同时采用一种无血清的精原干细胞培养液，不需要额外添加任何生长因子即可体外建系培养精原干细胞。此体系培养的精原干细胞与传统方法比较，增殖速率无显著差异，同时具备完整的再生潜能。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种无生长因子添加的精原干细胞培养体系及应用，无需添加任何重组生长因子同时克服含血清培养体系中成分不明的困难，可完全支持精原干细胞的体外培养。通过本发明公开的培养体系及高效表达重组生长因子GDNF的STO滋养层可以避免血清中复杂成分对于精原干细胞增殖的影响，不需要外源性重组生长因子的添加，在促进精原干细胞快速增殖的同时维持其干性，极大减少培养成本，简化了培养过程。

技术方案：一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系，包括含十二种明确化学成分组成的培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层，所述培养基每500mL含有牛血清白蛋白(BSA)0.6wt.％，转铁蛋白(Tf)100μg/mL，不饱和脂肪酸(FFA)15.2μeq/L，亚硒酸钠(Na₂SeO₃)6×10^-8M，2-巯基乙醇(2-ME)100μM，胰岛素(InsuLin)25μg/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)10mM，腐胺(Putrescine)120μM，青霉素(Penicillin)50units/mL(Gibco15140122(货号))，链霉素(Streptomycin)50μg/mL(Gibco15140122(货号))，L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM，其余为基础培养基MEMα，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸(FFA 100meq/L)包括：亚麻酸(Linolenic acid)5.6mM，十八烯酸(Oleic acid)13.4mM，棕搁油酸(Palmitoleic acid)2.8mM，亚油酸(Linoleic acid)35.6mM，十六烷酸(Palmitic acid)31mM，十八酸(Stearic acid)11.6mM，无水乙醇为溶剂。所述的过表达生长因子GDNF的滋养层细胞每2×10⁵细胞24小时GDNF分泌量为4.13ng/mL。

所述过表达生长因子GDNF的滋养层的制备方法为：1)用小鼠睾丸的cDNA为模板，通过PCR扩增反应，扩增出723bp的GDNF基因编码区片段，，引物如下：

GDNF-CDS-F：GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC；

GDNF-CDS-R：CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG；

2)通过琼脂糖凝胶电泳验证正确的GDNF编码区序列并切胶回收PCR产物；3)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体(System Biosciences公司购买)经过限制性内切酶XbaI和BamHI酶切消化后，琼脂糖凝胶电泳验证回收；4)酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体和回收的PCR产物连接，构建出pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表达载体；5)在10cm细胞培养皿中培养293T细胞(人肾上皮细胞)，用于包装病毒，病毒体系：ddH₂O:420μL，CaCl₂(2M):60μL，pSPAX2:2.5μg，pMD2.G：1μg，所制备的表达载体Plasmid:3.3μg，2×HBS:500μL，边涡旋边均匀滴加，空气吹打3次，再混匀吹打3次，均匀滴加至培养皿内，12h后换STO培养液，48h后收集培养皿中培养液，离心1500g，3min，将病毒上清用0.45μm滤器过滤分装，-80℃保存；6)0.1％明胶孵育12孔板30min，吸去明胶，加入1mL STO培养液/孔，1mL病毒上清重悬0.8×10⁵个STO细胞/孔，接种于12孔板；7)48h后收集转入病毒的STO细胞两孔，提取RNA及蛋白，验证在STO细胞中过表达GDNF成功；8)对验证过表达成功的STO细胞传代至10cm培养皿培养，并在细胞长满后用丝裂霉素C(MITC 10μg/mL)在37℃孵育3小时，每隔半小时摇晃混匀一次，10mL HBSS荡洗3次，去除残留的丝裂霉素C，质量浓度0.25％的胰酶(Trypsin-EDTA)1mL 37℃消化5min，3mL STO培养液终止消化，收集细胞，600g 5min 4℃离心，按1×10⁶个/细胞mL冻存，冻存液为90％体积STO培养液和10％体积二甲基亚砜(DMSO)，-80℃冻存过夜后转移至液氮，得到高效表达GDNF的STO细胞系，作为精原干细胞的滋养层细胞；上述STO培养液500mL含有:基础高糖培养基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-链霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巯基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm滤器过滤。

所述无生长因子添加的精原干细胞培养体系在精原干细胞培养中的应用。

所述精原干细胞为哺乳动物精原干细胞。

所述哺乳动物包括：小鼠，大鼠，家兔和恒河猴。

应用步骤包括：1)提前两天铺板，预热STO培养液，取全新24孔细胞培养板，加入质量浓度为0.1％的明胶(gelatin)铺满板底，37℃孵育30min，取出冻存的丝裂霉素C处理过的高效表达GDNF的STO细胞，37℃水浴锅复苏，将细胞转移至15mL离心管，加入4mL STO培养液，600g 4℃5min离心，弃上清，STO培养液5mL重悬细胞沉淀，对细胞进行计数按0.9-1×10⁵/500μL每孔接种于孔底；2)将磁珠分选得到的精原干细胞重悬于精原干细胞无血清培养液(1.5-2×10⁵/mL)；3)取出提前铺好的STO细胞，吸尽STO培养液，37℃预热的HBSS轻柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去残余培养液；4)吸尽HBSS后，将重悬在SSC培养液中的精原干细胞接种于板底(1.5-2×10⁵/孔)；5)细胞换液及传代：每2天细胞换液一次，每4-6天细胞传代一次转移至新的滋养层细胞上。

所述的高效表达GDNF的STO滋养层是STO细胞(由American type culture collection美国模式菌种收集中心购得，货号：SCRC-1050)经过构建的PCDH载体转染后高效持续表达GDNF，再经过丝裂霉素处理作为精原干细胞培养的滋养层细胞。

有益效果：利用本发明方法，可以长期体外培养精原干细胞，通过移植实验验证其干细胞特性与传统培养方法所培养的精原干细胞无差异。与传统培养方法相比，无需添加任何昂贵的重组生长因子及胎牛血清，培养基成分十分清晰，重复性好。应用本发明方法所培养的精原干细胞具备完整的再生潜能和无限增殖的能力。本发明方法培养简便，经济且高效。

附图说明

图1为过表达GDNF的病毒注射小鼠睾丸后形成精原干细胞过度增殖团块示意图(箭头所示)，说明包装质粒感染组织后能够正常产生有功能的GDNF重组因子，体内诱导精原干细胞过度增殖。

图2为蛋白定量检测验证与正常未感染GDNF过表达质粒的STO相比在STO-GDNF细胞系中GDNF蛋白显著表达示意图，(β-tubulin为骨架蛋白做为蛋白定量对照)。

图3为Elisa试剂盒(货号：ab171178，Abcam)检测2×10⁵GDNF-STO细胞24小时分泌GDNF量为2.57-5.69ng/mL，说明所述高效表达GDNF的STO可以体外分泌GDNF维持精原干细胞的生长。

图4为计数Brinster RL的传统培养方法、传统方法结合过表达GDNF的STO滋养层细胞及本发明方法三者比较示意图，说明本体系培养的精原干细胞增殖率无显著差异。

图5为在实施例1体系上培养的精原干细胞克隆(A图箭头所示)和该体系培养的精原干细胞移植回睾丸后形成克隆(B图箭头所示)说明该体系培养的精原干细胞具有完整的再生潜能。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

1、精原干细胞(SSC)培养液500mL配方：基础培养基(MEMα)，牛血清白蛋白(BSA)0.6％，转铁蛋白(Tf)100μg/mL，不饱和脂肪酸(FFA)15.2μeq/L，亚硒酸钠(Na₂SeO₃)6×10^-8M，2-巯基乙醇(2-ME)100μM，胰岛素(InsuLin)25μg/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)10mM，腐胺(Putrescine)120μM，青霉素(Penicillin)50units/mL(Gibco15140122(货号))，链霉素(Streptomycin)50μg/mL(Gibco15140122(货号))，L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸(FFA 100meq/L)包括：亚麻酸(Linolenic acid)5.6mM，十八烯酸(Oleic acid)13.4mM，棕搁油酸(Palmitoleic acid)2.8mM，亚油酸(Linoleic acid)35.6mM，十六烷酸(Palmitic acid)31mM，十八酸(Stearic acid)11.6mM，无水乙醇为溶剂。

2、STO细胞系培养所用培养液500mL配方:基础高塘培养基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-链霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巯基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm滤器过滤。HBS每500mL含有：NaCl-8g，KCl-0.38g，Na₂HPO₄-0.1g，Hepes-5g，Glucose-1g，pH 7.05。

3、所用培养液试剂购买来源：基础培养基(MEMα，DMEM)Gibco，牛血清白蛋白(BSA)Sigma，转铁蛋白(Tf)Sigma，不饱和脂肪酸(FFA)Sigma，亚硒酸钠(Na₂SeO₃)Sigma，2-巯基乙醇(2-ME)Sigma，胰岛素(InsuLin)Sigma，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)Sigma，腐胺(Putrescine)Sigma，青霉素-链霉素(P&S)Gibco，L-谷氨酰胺(L-glutamine)Gibco，血清(FBS)Hyclone。

4、高效表达重组生长因子GDNF的滋养层细胞系的构建，包括以下几个步骤：

1)用小鼠睾丸的cDNA为模板，通过PCR扩增反应，扩增出723bp的GDNF基因编码区片段，所用引物如下：

GDNF-CDS-F：GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC；

GDNF-CDS-R：CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG。

2)通过琼脂糖凝胶电泳验证正确的GDNF编码区序列并切胶回收PCR产物；

3)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(System Biosciences公司购买)经过限制性内切酶XbaI和BamHI酶切消化后，琼脂糖凝胶电泳验证回收；

4)酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体和回收的PCR产物连接，连接体系：回收酶切载体：6.8μL，回收PCR产物：1.2μL，T4DNA Ligase(T4DNA连接酶)：1μL，10×T4DNA Ligase Buffer:1μL，4℃过夜，构建表达载体；

5)对构建好的pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表达载体进行XbaI和BamHI双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳验证正确后送测序，测序结果显示扩增出的GDNF基因与NCBI基因库中GDNF基因序列匹配率100％。

6)在10cm细胞培养皿中培养293T细胞，用于包装病毒，病毒体系：ddH₂O:420μL，CaCl₂(2M):60μL，pSPAX2:2.5μg，pMD2.G：1μg，所制备的表达载体Plasmid:3.3μg，2×HBS:500μL(边涡旋边均匀滴加)，空气吹打3次，再混匀吹打3次，均匀滴加至培养皿内，12h后换STO培养液，48h后收集培养皿中的培养液，离心1500g，3min，将病毒上清用0.45μm滤器过滤分装，-80℃保存。

7)0.1％明胶(gelatin)孵育12孔板30min，吸去明胶，加入1mL STO培养液/孔，1mL病毒重悬0.8×10⁵个STO细胞/孔，接种于12孔板。

8)48h后收集转入病毒的STO细胞两孔用于提取RNA及蛋白验证在STO细胞中过表达GDNF成功。

9)对验证成功的STO细胞传代至10cm培养皿培养，并在细胞长满后用丝裂霉素C(10μg/mL)在37℃孵育3小时，每个半小时摇晃混匀，共10mL HBSS荡洗3次，去除残留的丝裂霉C，0.25％Trypsin-EDTA 1mL 37℃消化5min，3mL STO培养液终止消化，收集细胞，600g 5min 4℃离心，按1×10⁶个细胞/mL冻存，冻存液为90％体积STO培养液和10％体积二甲基亚砜(DMSO)，-80℃冻存过夜后转移至液氮，得到高效表达GDNF的滋养层细胞。

5、精原干细胞无血清培养液及过表达GDNF的STO细胞在精原干细胞培养中应用步骤包括：

1)提前两天铺板，预热STO培养液，取全新24孔细胞培养板，加入0.1％明胶，铺满板底，37℃孵育30min，，取出冻存的丝裂霉素C处理过的高效表达GDNF的STO细胞，37℃水浴锅复苏，将细胞转移至15mL离心管，加入4mL STO培养液，600g 4℃离心5min，弃上清，STO培养液5mL重悬细胞沉淀，对细胞进行计数，吸去明胶后按0.9-1×10⁵个细胞/500μL每孔接种于孔底；

2)将磁珠分选得到的精原干细胞重悬于精原干细胞无血清培养液(1.5-2×10⁵个细胞/mL)；

3)取出提前铺好的滋养层细胞，吸尽STO培养液，37℃预热的HBSS轻柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去残余培养液；

4)吸尽HBSS后，将重悬在SSC培养液中的精原干细胞接种于板底(1.5-2×10⁵个细胞/孔)；

5)细胞换液及传代：每2天细胞换液一次，每4-6天细胞传代一次转移至新的滋养层细胞上。

6、通过对在高表达GDNF的STO滋养层上建系培养的精原干细胞移植，发现所培养的精原干细胞具有干细胞再生潜能和无限增殖的特性，证明本发明所公开的方法真实可靠，简单经济。

实施例2

该实施例与实施例1相比仅使用普通STO细胞作为滋养层细胞。

1、精原干细胞(SSC)无血清培养液500mL配方：基础培养基(MEMα)，牛血清白蛋白(BSA)0.6％，转铁蛋白(Tf)100μg/mL，不饱和脂肪酸(FFA)15.2μeq/L，亚硒酸钠(Na₂SeO₃)6×10^-8M，2-巯基乙醇(2-ME)100μM，胰岛素(InsuLin)25μg/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)10mM，腐胺(Putrescine)120μM，青霉素(Penicillin)50units/mL(Gibco15140122(货号))，链霉素(Streptomycin)50μg/mL(Gibco15140122(货号))，L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸(FFA 100meq/L)包括：亚麻酸(Linolenic acid)5.6mM，十八烯酸(Oleic acid)13.4mM，棕搁油酸(Palmitoleic acid)2.8mM，亚油酸(Linoleic acid)35.6mM，十六烷酸(Palmitic acid)31mM，十八酸(Stearic acid)11.6mM，无水乙醇为溶剂。

2、STO细胞系培养所用培养液500mL配方:基础高塘培养基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-链霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巯基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm滤器过滤。

3、所用培养液试剂购买来源：基础培养基(MEMα，DMEM)Gibco，牛血清白蛋白(BSA)Sigma，转铁蛋白(Tf)Sigma，不饱和脂肪酸(FFA)Sigma，亚硒酸钠(Na₂SeO₃)Sigma，2-巯基乙醇(2-ME)Sigma，胰岛素(InsuLin)Sigma，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)Sigma，腐胺(Putrescine)Sigma，青霉素-链霉素(P&S)Gibco，L-谷氨酰胺(L-glutamine)Gibco，血清(FBS)Hyclone

4、在10cm培养皿中培养正常STO细胞并在细胞长满后用丝裂霉素C(10μg/mL)在37℃孵育3小时，每个半小时摇晃混匀，10mL HBSS荡洗3次，去除残留的丝裂霉C，0.25％Trypsin-EDTA1mL 37℃消化5min，3mLSTO培养液终止消化，收集细胞，600g 5min 4℃离心，按1×10⁶个/细胞mL冻存，冻存液为90％体积STO培养液和10％体积二甲基亚砜(DMSO)，-80℃冻存过夜后转移至液氮，得到正常滋养层细胞。

5、提前两天铺板，预热STO培养液，取全新24孔细胞培养板，加入0.1％明胶，铺满板底，37℃孵育30min，，取出冻存的丝裂霉素MITC处理过的正常STO细胞37℃水浴锅复苏，将细胞转移至15mL离心管，加入4mLSTO培养液，600g 4℃5min离心，弃上清，STO培养液5mL重悬细胞沉淀，对细胞进行计数，吸去明胶后按0.9-1×10⁵/500μL每孔接种于孔底

6、将磁珠分选得到的精原干细胞重悬于精原干细胞无血清培养液(1.5-2×10⁵/mL)；取出提前铺好的滋养层细胞，吸尽STO培养液，37℃预热的HBSS轻柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去残余培养液；吸尽HBSS后，将重悬在SSC培养液中的精原干细胞接种于板底(1.5-2×10⁵/孔)，2天后换液观察发现细胞形成克隆较小，随着培养时间延长，细胞逐渐死亡减少，不能传代培养。说明该体系不能支持精原干细胞体外培养。

实施例3

该实施例与实施例1相比仅在精原干细胞培养液中加入体积1％的血清(FBS)。

1、精原干细胞(SSC)含血清培养液500mL配方：基础培养基MEMα，牛血清白蛋白0.6％，转铁蛋白100μg/mL，不饱和脂肪酸15.2μeq/L，亚硒酸钠6×10^-8M，2-巯基乙醇100μM，胰岛素25μg/mL，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mM，腐胺120μM，青霉素50units/mL，链霉素50μg/mL，L-谷氨酰胺2mM，，FBS(胎牛血清):5mL，0.22μm滤器过滤；每毫升所述不饱和脂肪酸包括：亚麻酸5.6mM，十八烯酸13.4mM，棕搁油酸2.8mM，亚油酸35.6mM，十六烷酸31mM，十八酸11.6mM，无水乙醇为溶剂。

2、STO细胞系培养所用培养液500mL配方:基础高塘培养基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-链霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巯基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm滤器过滤。

3、所用培养液试剂购买来源：基础培养基(MEMα，DMEM)Gibco，牛血清白蛋白(BSA)Sigma，转铁蛋白(Tf)Sigma，不饱和脂肪酸(FFA)Sigma，亚硒酸钠(Na₂SeO₃)Sigma，2-巯基乙醇(2-ME)Sigma，胰岛素(InsuLin)Sigma，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)Sigma，腐胺(Putrescine)Sigma，青霉素-链霉素(P&S)Gibco，L-谷氨酰胺(L-glutamine)Gibco，血清(FBS)Hyclone。

4、在10cm培养皿中培养验证成功过表达GDNF的STO细胞并在细胞长满后用丝裂霉素C(10μg/mL)在37℃孵育3小时，每个半小时摇晃混匀，10mL HBSS荡洗3次，去除残留的丝裂霉C，0.25％Trypsin-EDTA1mL 37℃消化5min，3mLSTO培养液终止消化，收集细胞，600g 5min 4℃离心，按1×10⁶个/细胞mL冻存，冻存液为90％体积STO培养液和10％体积二甲基亚砜(DMSO)，-80℃冻存过夜后转移至液氮，得到高效表达GDNF的滋养层细胞。

5、提前两天铺板，预热STO培养液，取全新24孔细胞培养板，加入0.1％明胶，铺满板底，37℃孵育30min，，取出冻存的丝裂霉素MITC处理过的高效表达GDNF的STO细胞37℃水浴锅复苏，将细胞转移至15mL离心管，加入4mLSTO培养液，600g 4℃5min离心，弃上清，STO培养液5mL重悬细胞沉淀，对细胞进行计数，吸去明胶后按0.9-1×10⁵/500μL每孔接种于孔底。

6、将磁珠分选得到的精原干细胞重悬于精原干细胞含血清培养液(1.5-2×10⁵/mL)；取出提前铺好的滋养层细胞，吸尽STO培养液，37℃预热的HBSS轻柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去残余培养液；吸尽HBSS后，将重悬在SSC含血清培养液中的精原干细胞接种于板底(1.5-2×10⁵/孔)。

7、细胞换液及传代：每2天细胞换液一次，每4-6天细胞传代一次转移至新的滋养层细胞上。

8、通过在含血清培养基上培养的精原干细胞细胞移植，发现其所培养的精原干细胞形成的克隆与本发明公开的培养体系相比，克隆数目显著减少，说明其不支持精原干细胞体外增殖。

以上所述为本发明较佳实施例，应当理解的是，对于本行业研究人员可利用以上公开技术而加以改变或调整，而这些改变或调整都属于本发明所附权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> 一种无生长因子和血清添加的精原干细胞培养体系及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctctagagc caccatgaag ttatgggatg tc 32

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgggatccga tacatccaca ccgtttag 28