一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系及应用的制作方法

文档序号:12108608阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系,其特征在于包括含十二种明确化学成分组成的培养基和过表达生长因子GDNF的滋养层,所述培养基每500mL含有牛血清白蛋白0.6wt.%,转铁蛋白100μg/mL,不饱和脂肪酸15.2μeq/L,亚硒酸钠6×10-8M, 2-巯基乙醇100μM,胰岛素25μg/mL, 4-羟乙基哌嗪乙磺酸10mM,腐胺120μM,青霉素50units/mL,链霉素50μg/mL, L-谷氨酰胺2mM,其余为基础培养基MEMα,0.22μm滤器过滤;每毫升所述不饱和脂肪酸包括:亚麻酸5.6mM,十八烯酸13.4 mM,棕搁油酸2.8 mM,亚油酸35.6 mM,十六烷酸31 mM,十八酸11.6 mM,无水乙醇为溶剂;所述的过表达生长因子GDNF的滋养层细胞每2×105细胞24小时GDNF分泌量为4.13ng/mL。

2.根据权利要求1所述无重组生长因子添加的精原干细胞培养体系,其特征在于所述过表达GDNF的滋养层细胞的制备方法为:

1)用小鼠睾丸的cDNA为模板,通过PCR扩增反应,扩增出723bp的GDNF基因编码区片段,引物如下:

GDNF-CDS-F:GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC;

GDNF-CDS-R:CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG;

2)通过琼脂糖凝胶电泳验证正确的GDNF开放阅读框并切胶回收PCR产物;

3)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体经过限制性内切酶XbaI和BamHI酶切消化后,琼脂糖凝胶电泳验证回收;

4)酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro载体和回收的PCR产物连接,构建出pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表达载体;

5)在10cm细胞培养皿中培养293T细胞,用于包装病毒,病毒体系:ddH2O:420μL,2M CaCl2:60μL,pSPAX2:2.5μg ,pMD2.G:1μg ,(所制备的表达载体)Plasmid:3.3μg,2×HBS:500μL,边涡旋边均匀滴加,空气吹打3次,再混匀吹打3次,均匀滴加至培养皿内,12h后换STO培养液,48h后收集培养皿中培养液,离心1500g,3min,将病毒上清用0.45μm滤器过滤分装,-80℃保存;

6)0.1%明胶孵育12孔板30min,吸去明胶,加入1mL STO培养液/孔,1mL病毒上清重悬0.8×105个STO细胞/孔,接种于12孔板;

7)48h后收集转入病毒的STO细胞两孔,提取RNA及蛋白,验证在STO细胞中过表达GDNF成功;

8)对验证过表达成功的STO细胞传代至10cm培养皿培养,并在细胞长满后用10μg/mL丝裂霉素C在37℃孵育3小时,每隔半小时摇晃混匀一次,10mL HBSS荡洗3次,去除残留的丝裂霉素C,质量浓度0.25%的胰酶1mL 37℃消化5min,3mL STO培养液终止消化,收集细胞,600g 5min 4℃离心,按1×106个/细胞mL冻存,冻存液为90%体积STO培养液和10%体积二甲基亚砜,-80℃冻存过夜后转移至液氮,得到高效表达GDNF的STO细胞系,作为精原干细胞的滋养层细胞;上述STO培养液500mL含有:基础高糖培养基:455mL,FBS血清:35mL,青霉素-链霉素:5mL,L-谷氨酰胺5mL,2-巯基乙醇:3.6μL,0.22μm滤器过滤。

3.权利要求1或2所述无生长因子添加的精原干细胞培养体系在精原干细胞培养中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述精原干细胞为哺乳动物精原干细胞。

5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述哺乳动物包括:小鼠,大鼠,家兔和恒河猴。

6.根据权利要求3所述应用,其特征在于步骤包括:

1)提前两天铺板,预热STO培养液,取全新24孔细胞培养板,加入质量浓度为0.1%的明胶铺满板底,37℃孵育30min,取出冻存的丝裂霉素C处理过的高效表达GDNF的STO细胞,37℃水浴锅复苏,将细胞转移至15mL离心管,加入4mL STO培养液,600g 4℃5min 离心,弃上清,STO培养液5mL重悬细胞沉淀,对细胞进行计数按0.9-1×105 /500μL每孔接种于孔底;

2)将磁珠分选得到的精原干细胞重悬于精原干细胞无血清培养液至1.5-2×105/mL;

3)取出提前铺好的STO细胞,吸尽STO培养液,37℃预热的HBSS轻柔清洗三遍,每次1mL/孔,洗去残余培养液;

4)吸尽HBSS后,将重悬在SSC培养液中的精原干细胞接种于板底至1.5-2×105/孔;

5)细胞换液及传代:每2天细胞换液一次,每4-6天细胞传代一次转移至新的滋养层细胞上。

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