一种利用导电载体驯化丙酸产甲烷生物膜的方法与流程

本发明涉及微生物发酵生产清洁能源技术领域，具体涉及一种利用导电载体驯化丙酸产甲烷生物膜的方法。

背景技术：
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厌氧发酵制备生物燃气技术已经被世界各国公认为最有效的有机废弃物处理技术，非常适合处理含水率较高且容易生物降解的有机物。以有机废弃物为原料制备生物质燃气，既能减少污染物的排放，其产生的清洁燃气又替代化石能源和林木薪柴的消耗，实现进一步减排，具有双向清洁功能，是应对气候变化的重大举措。在厌氧发酵过程中极易出现酸抑制情况，导致系统失稳，产气率降低、发酵周期拉长，甚至发酵失败。酸抑制往往伴随着丙酸的积累，根据热力学分析，丙酸的降解因受氢分压等因素影响难以自发进行，只有在大量共生菌种的作用下才能够实现降解，因此丙酸降解是厌氧发酵的限速步骤。丙酸的积累致使发酵系统pH降低，抑制了产甲烷菌的活性，最终导致发酵系统产气能力下降或者发生酸化。通常的解决方法是宏观上优化运行参数，如投加碱调节pH，或者降低有机负荷和发酵浓度，使发酵在相对较低的发酵浓度下运行，限制了发酵效率。随着生物强化技术在废水处理领域的应用，研究人员开始尝试将其应用到沼气发酵系统中，即人为的添加特定功能的微生物来应对酸抑制，提高发酵系统的稳定性。但目前投加功能菌群多为购买纯培养复合菌剂，环境条件要求苛刻，难以适应复杂环境而发挥强化作用。

因此，为获得生物活性稳定且高效降解丙酸的生物强化菌剂，有必要提出一种有效地驯化及菌剂制备方法。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种利用导电载体驯化丙酸产甲烷生物膜的方法，通过在厌氧发酵体系中设置导电载体，以丙酸和丙酸钠为碳源，驯化丙酸产甲烷菌系并形成生物膜，有效提高丙酸降解效率，解除系统酸抑制，提升厌氧体系的稳定性。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种利用导电载体驯化丙酸产甲烷生物膜的方法，该方法在厌氧发酵体系中设置导电载体，以丙酸和丙酸钠为碳源，以沼气发酵液为接种物，以导电载体为生物膜附着载体，通过阶梯性提高有机负荷至3.0g/L，同时阶梯性提高丙酸与丙酸钠的摩尔比至4：1，获得有机负荷大于3.0g/L，理论产甲烷率大于70％的产甲烷生物膜，具体包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，按体积比为14:1将接种物接种到培养基中进行培养，培养温度为37℃，每24h置换培养基，15天为一个培养周期，培养10-15天后加入导电载体，使其全部浸没于发酵液中，此后每个培养周期阶梯性提高有机负荷及培养基中丙酸与丙酸钠的摩尔比，直至有机负荷大于3.0g/L、丙酸与丙酸钠的摩尔比为4：1，获得了目标产物；所述培养基配制如下：在1L水中加入400mg NH₄Cl、250mg MgSO₄·6H₂O、400mg KCl、120mgCaCl₂·2H₂O、80mg(NH₄)₂HPO₄、55mg FeCl₃·6H₂O、5000mg NaHCO₃、不同摩尔比的丙酸与丙酸钠，还加入CoCl₂·6H₂O、NiCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、CuCl₂·2H₂O、AlCl₃·6H₂O、ZnCl₂、Na₂WO₄·2H₂O、H₃BO₃、Na₂SeO₃、Ma₂MoO₄·2H₂O各0.0005mg。

所述导电载体选自导电碳毡、碳纤维毛刷等。

厌氧消化过程中除种间氢传递机制外，直接种间电子传递(direct interspecies electron transfer,DIET)机制同样被证实存在，而且可以通过添加导电物质得以强化。直接种间电子传递(简称DIET)途径降解丙酸、丁酸等酸化产物可有效规避氢分压带来的热力学限制。本发明在设置有导电载体的容器内进行丙酸产甲烷菌的驯化，可以增强产甲烷菌降解丙酸的能力，并在导电载体上形成生物膜，生物膜上的微生物通过直接种间电子传递(简称DIET)途径实现丙酸的高效降解。

本发明还保护所述丙酸产甲烷生物膜的应用，应用于厌氧发酵体系中。

本发明的有益效果如下：

1)本发明通过在厌氧发酵体系中设置导电载体，利用导电载体驯化高效丙酸产甲烷菌，并使其形成生物膜富集，生物膜上的微生物通过直接种间电子传递(简称DIET)途径实现丙酸的高效降解，应用于厌氧发酵体系中可以解除氢分压等因素带来的热力学限制，有效提高丙酸降解效率，有效的缓解丙酸积累带来的发酵抑制，提高厌氧发酵系统的稳定性，提高厌氧发酵效率，降低厌氧发酵酸败几率，其产气率为理论产量的75％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。

2)本发明驯化得到的丙酸产甲烷生物膜，可直接加入到酸抑制特别是丙酸和乙酸抑制的发酵系统中，能够缩短酸抑制期，提高系统效率和稳定性。

附图说明：

图1是本发明实施例的在线自动采气培养装置结构示意图；

其中，1、电脑，2、流量计，3、第一发酵罐，4、第二发酵罐，5、碳纤维毛刷。

图2是发酵前的碳纤维毛刷；

图3是发酵后的碳纤维毛刷；

图4是实施例2利用本发明驯化得到的丙酸产甲烷生物膜作用于餐厨垃圾厌氧消化系统的效果图。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

所述培养基配制如下：在1L水中加入400mg NH₄Cl、250mg MgSO₄·6H₂O、400mg KCl、120mg CaCl₂·2H₂O、80mg(NH₄)₂HPO₄、55mg FeCl₃·6H₂O、5000mg NaHCO₃、不同摩尔比的丙酸与丙酸钠，还加入CoCl₂·6H₂O、NiCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、CuCl₂·2H₂O、AlCl₃·6H₂O、ZnCl₂、Na₂WO₄·2H₂O、H₃BO₃、Na₂SeO₃、Ma₂MoO₄·2H₂O各0.0005mg。

接种物取自养牛场牛粪沼气池发酵液，有机负荷2.0g/L，日容积产气率为1.1L/L d。

培养装置采用如图1所示的2L CSTR在线自动采气培养装置。其中第一发酵罐3和第二发酵罐4为皆为2L厌氧发酵瓶，区别在于第一发酵罐3内不设置碳纤维毛刷，第二发酵罐4设有市场上购买的碳纤维毛刷，其他培养条件相同，第一发酵罐3和第二发酵罐4的日产气量由流量计2记录并传送到电脑1进行记录。

利用导电载体驯化丙酸产甲烷生物膜的方法包括以下步骤：在氮气和二氧化碳体积比为4:1的混合气氛中，第一发酵罐3和第二发酵罐4各取2100ml接种物接种到150ml培养基中进行培养，培养温度为37℃，每24h用注射器吸出150ml的菌液，并注入150ml新鲜的培养基，15天为一个培养周期，培养10-15天后加入碳纤维毛刷，使其全部浸没于发酵液中，此后每个培养周期阶梯性提高有机负荷及培养基中丙酸与丙酸钠的摩尔比(参见表1)，直至有机负荷大于3.0g/L、丙酸与丙酸钠的摩尔比为4：1，获得了产甲烷率大于理论产量的70％的高效丙酸产甲烷生物膜。

表1

通过10个周期的驯化，第一发酵罐3随着丙酸比值的增加和有机负荷的提高，在第125天(丙酸：丙酸钠的摩尔比等于4：1，有机负荷为2.5g/L)酸败并停止产气，而第二发酵罐4获得了可长期稳定地在有机负荷在3.0g/L，丙酸和丙酸钠的摩尔比4：1条件下高效利用丙酸产甲烷生物膜，其产气率为理论产量的75％，丙酸及乙酸的利用率大于90％。将第二发酵罐4内的碳纤维毛刷5取出进行观察，如图3可见，碳纤维毛刷5上附着了大量黏稠状的物质，经微生物分析，其上优势菌群主要为Methanospirillum和Methanosaeta两种，其通过种间电子直接传递途径(DIET)降解丙酸。

实施例2：驯化得到的丙酸产甲烷生物膜应用于实验室的餐厨垃圾发酵系统。

餐厨垃圾俗称泔水，富含有机质，极易腐烂变质，形成健康隐患和环境污染等问题。以餐厨垃圾为原料进行厌氧制备沼气能够实现餐厨垃圾资源化利用，但是厌氧过程中，餐厨垃圾极易酸化，特别是丙酸和乙酸的积累，抑制产甲烷的顺利进行。本实验室在TS浓度为12％，中温37℃下进行厌氧发酵批式实验，在发酵第10天达到产气高峰，第15至25天一直处于酸抑制状态，直到第30天左右，停止产气。在相同条件下，第15天直接加入本实施例1驯化得到的丙酸产甲烷生物膜，系统恢复产气，并在第20天达到产气高峰，发酵时间缩短至25天(参见图4)。