本发明属于间充质干细胞的培养基领域，特别涉及一种大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基。
背景技术：
间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前,我们能够从骨髓、脂肪、脐带、滑膜、骨骼等组织中分离和制备间充质干细胞，其中研究最早的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓组织取材不易，难以大规模生产。当前研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。
间充质干细胞已用于治疗十余种难治性疾病的治疗研究，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病，肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。间充质干细胞作用机理尚不完全明确，一般认为主要通过以下机制：1、旁分泌作用(分泌细胞营养因子、细胞生长因子、抗凋亡因子等)。2、代替或修复死亡或受损的细胞。3、细胞直接接触，调控细胞的功能。当前，越来越多的研究表明，间充质干细胞的旁分泌效应在其发挥治疗效果中其主要作用。间充质干细胞通过分泌各类细胞因子对邻近细胞产生作用，从而发挥其功效。研究表明，间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如VEGF(血管内皮生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、NGF(神经生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子1)、BDNF(脑源性神经营养因子)、GDNF(胶质源性神经营养因子)、IL-6(白细胞介素6)、IL-11(白细胞介素11)等。间充质干细胞分泌活性因子具有改善炎性环境、调节机体免疫状态、抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、促进血管再生、促进神经干细胞迁移和分化、促进轴突生长及突触连接形成、促进髓鞘形成的功能，通过脑白质损伤的动物模型证实可以抑制宿主细胞及移植细胞凋亡、改善模型鼠的神经功能，通过心梗动物模型证实可以促进心功能恢复，通过皮肤损伤实验证实可以促进伤口愈合。
目前对干细胞的研究集中于干细胞的增殖和诱导分化，对于利用干细胞生产分泌因子的研究较少。培养间充质干细胞收集培养液或细胞裂解液，存在培养规模较小，诱导细胞因子分泌过程不够高效，分离纯化过程不具规模化、分泌的活性因子得不到充分利用问题。CN104099294A公开了一种基于干细胞分泌生物因子的培养基及其制备和使用方法，收集干细胞培养扩增过程中更换的废弃培养液，将其进行冻融、低温分离、超滤和浓缩，得到富含丰富生物活性因子的溶液，按照一定的比例添加到基础培养基中。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提出了一种大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，具体如下：
一种大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，所述诱导分泌培养基主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸溶解于磷酸盐缓冲液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸在诱导分泌培养基中的浓度分别为400-600ml/L、1-3mmol/L、10-20μmol/L、10-20g/L、10-100μmol/L。
优选的，DMEM、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸在诱导分泌培养基中的浓度分别为500ml/L、2mmol/L、15μmol/L、15g/L、50μmol/L。
优选的，所述诱导分泌培养基还包括诱导增强剂，所述诱导增强剂在诱导分泌培养基中浓度为1-2g/L，所述诱导增强剂包括10-20重量份的三磷酸腺苷、10-20重量份的三磷酸鸟苷、10-50重量份环磷酸鸟苷和5-20重量份的NaNO3。
进一步优选的，所述诱导增强剂在诱导分泌培养基中浓度为1.5g/L。
更进一步优选的，所述诱导增强剂包括15重量份的三磷酸腺苷、15重量份的三磷酸鸟苷、20重量份环磷酸鸟苷和10重量份的NaNO3。
优选的，所述诱导分泌培养基还包括分泌增强剂，所述分泌增强剂在诱导分泌培养基中浓度为0.1-1g/L，所述分泌增强剂包括10-20重量份的甘油、10-20重量份的亚麻酸、10-50重量份二十二碳六烯酸和1-10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
更进一步优选的，所述分泌增强剂在诱导分泌培养基中浓度为0.5g/L。
更进一步优选的，所述分泌增强剂包括15重量份的甘油、15重量份的亚麻酸、20重量份二十二碳六烯酸和5重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
本发明还公开了制备大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基的方法，包括以下步骤：
a取配置培养基目标体积四分之一的磷酸盐缓冲液，充分搅拌；
b依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸，充分搅拌；
c用磷酸盐缓冲液定容至目标体积。
本发明还公开了另一种大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基的方法，包括以下步骤：
a取配置培养基目标体积四分之一的磷酸盐缓冲液，充分搅拌；
b1依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸，充分搅拌；
b2依次加入三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、环磷酸鸟苷、NaNO3和甘油，充分搅拌；
b3加入脂肪醇聚氧乙烯醚充分搅拌，依次加入亚麻酸和二十二碳六烯酸，充分搅拌；
c用磷酸盐缓冲液定容至目标体积。
本发明中，所述DMEM为高糖型液体培养基，购自Thermo Fisher Scientific，货号：11995-065，所述磷酸盐缓冲液为1倍磷酸盐缓冲液，pH为7.4。
本发明的一种实施方式公开了大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，适用于大规模培养的人脐带间充质干细胞，可以高效的诱导分泌活性因子；本发明的一种实施方式公开了大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基的制备方法。
具体实施方式
实施例1
大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸溶解于磷酸盐缓冲液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸在诱导分泌培养基中的浓度分别为400ml/L、1mmol/L、10μmol/L、10g/L、10μmol/L。
实施例2
大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸溶解于磷酸盐缓冲液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸在诱导分泌培养基中的浓度分别为600ml/L、3mmol/L、20μmol/L、20g/L、100μmol/L。
实施例3
大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸溶解于磷酸盐缓冲液而成，DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸在诱导分泌培养基中的浓度分别为500ml/L、2mmol/L、15μmol/L、15g/L、50μmol/L。
实施例4
与实施例3的不同之处在于，所述诱导分泌培养基还包括诱导增强剂，所述诱导增强剂在诱导分泌培养基中浓度为1g/L，所述诱导增强剂包括10重量份的三磷酸腺苷、10重量份的三磷酸鸟苷、10重量份环磷酸鸟苷和5重量份的NaNO3。
实施例5
与实施例3的不同之处在于，所述诱导分泌培养基还包括诱导增强剂，所述诱导增强剂在诱导分泌培养基中浓度为2g/L，所述诱导增强剂包括20重量份的三磷酸腺苷、20重量份的三磷酸鸟苷、50重量份环磷酸鸟苷和20重量份的NaNO3。
实施例6
与实施例3的不同之处在于，所述诱导分泌培养基还包括诱导增强剂，所述诱导增强剂在诱导分泌培养基中浓度为1.5g/L，所述诱导增强剂包括15重量份的三磷酸腺苷、15重量份的三磷酸鸟苷、20重量份环磷酸鸟苷和10重量份的NaNO3。
实施例7
与实施例6的不同之处在于，所述诱导分泌培养基还包括分泌增强剂，所述分泌增强剂在诱导分泌培养基中浓度为0.1g/L，所述分泌增强剂包括10重量份的甘油、10重量份的亚麻酸、10重量份二十二碳六烯酸和1重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
实施例8
与实施例6的不同之处在于，所述诱导分泌培养基还包括分泌增强剂，所述分泌增强剂在诱导分泌培养基中浓度为1g/L，所述分泌增强剂包括20重量份的甘油、20重量份的亚麻酸、50重量份二十二碳六烯酸和10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
实施例9
与实施例6的不同之处在于，所述诱导分泌培养基还包括分泌增强剂，所述分泌增强剂在诱导分泌培养基中浓度为0.5g/L，所述分泌增强剂包括15重量份的甘油、15重量份的亚麻酸、20重量份二十二碳六烯酸和5重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
实施例10
制备大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基的方法，包括以下步骤：
a取配置培养基目标体积四分之一的磷酸盐缓冲液，充分搅拌；
b依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸，充分搅拌；
c用磷酸盐缓冲液定容至目标体积。
实施例11
制备大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基的方法，，包括以下步骤：
a取配置培养基目标体积四分之一的磷酸盐缓冲液，充分搅拌；
b1依次加入DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸，充分搅拌；
b2依次加入三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、环磷酸鸟苷、NaNO3和甘油，充分搅拌；
b3加入脂肪醇聚氧乙烯醚充分搅拌，依次加入亚麻酸和二十二碳六烯酸，充分搅拌；
c用磷酸盐缓冲液定容至目标体积。
对照例1
大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，主要由DMEM、D-葡萄糖和L-抗坏血酸溶解于磷酸盐缓冲液而成，DMEM、D-葡萄糖和L-抗坏血酸在诱导分泌培养基中的浓度分别为100ml/L、10g/L、50μmol/L。
对照例2
大规模制备人脐带间充质干细胞因子用诱导分泌培养基，主要由DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和D-葡萄糖溶解于磷酸盐缓冲液而成，DMEM、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸和D-葡萄糖在诱导分泌培养基中的浓度分别为800ml/L、10μmol/L、20g/L。
对照例3
与实施例4的不同之处在于，诱导增强剂在诱导分泌培养基中的浓度为1g/L，所述诱导增强剂包括10重量份的三磷酸腺苷、10重量份的三磷酸鸟苷。
对照例4
与实施例4的不同之处在于，诱导增强剂在诱导分泌培养基中的浓度为5g/L，所述诱导增强剂包括10重量份环磷酸鸟苷和5重量份的NaNO3。
对照例5
与实施例7的不同之处在于，所述分泌增强剂在诱导分泌培养基中浓度为0.1g/L，所述分泌增强剂包括20重量份的甘油、20重量份的亚麻酸。
对照例6
与实施例7的不同之处在于，所述分泌增强剂在诱导分泌培养基中浓度为1g/L，所述分泌增强剂包括50重量份二十二碳六烯酸和10重量份的脂肪醇聚氧乙烯醚。
实验例诱导分泌培养基对于人脐带间充质干细胞分泌活性因子的影响
取人脐带间充质干细胞的4代细胞，消化计数后，按2×104/ml密度接种与市售的间充质干细胞无血清培养基MSCSFMGIBCOA10332-01，于三气培养箱37℃、5％CO2、20％O2培养。培养72h，细胞长至80％融合，此时弃掉无血清培养基。按无血清培养基一半体积添加诱导分泌培养基，调整培养参数为37℃、5％CO2、5％O2。24h后调整培养参数为37℃、5％CO2、20％O2。48h后取出一半诱导分泌培养基用于制备细胞因子，同时补加等量诱导分泌培养基放回三气培养箱继续培养，调整培养参数为37℃、5％CO2、5％O2。72h后取出全部诱导分泌培养基，用于制备细胞因子。通过无菌泵将培养液泵至中空纤维膜微滤过滤器中的0.1μm空纤维微滤膜，循环过滤，以除去死细胞及碎片，滤液用无菌泵泵至流超滤膜包(截留分子量5kD)，循环过滤至原体积1/50。用磷酸盐缓冲液补至原体积继续超滤。循环过滤至原体积1/50后，用生理盐水补至原体积继续超滤，体积浓缩为原体积1/50后，移至生物安全柜，在生物安全柜中将纯化浓缩液收集至合适离心管，稀释至合适浓度后，取样，ELISA法测定VEGF(血管内皮生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、GDNF(胶质源性神经营养因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的浓度，试剂盒购自Thermo Fisher Scientific。
活性因子的浓度为检测结果按照稀释浓度折算后的浓度。使用的诱导分泌培养基为实施例1-9和对照例1-6的培养基，每个培养基重复三次，活性因子浓度取平均值。
表1诱导分泌培养基对于人脐带间充质干细胞分泌活性因子的影响
从表1可以看出，活性因子VEGF(血管内皮生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、GDNF(胶质源性神经营养因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的浓度，实施例1-3显著高于(P<0.05)对照例1-2，说明DMEM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸、D-葡萄糖和L-抗坏血酸合适浓度配置成的培养基在大规模制备人脐带间充质干细胞因子中能够有效诱导分泌生长因子；实施例4-6显著高于(P<0.05)对照例3-4说明，诱导增强剂三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、环磷酸鸟苷和NaNO3能够促进诱导分析活性因子；实施例7-9显著高于(P<0.05)对照例5-6说明，分泌增强剂甘油、亚麻酸、二十二碳六烯酸和脂肪醇聚氧乙烯醚能够进一步促进诱导分析活性因子。
以上仅为本发明的实施例而已。对于本领域的技术人员来说，很容易根据上述披露的精神对这些实施例作出多种更改和变化。这些更改和变化均包含在本申请权利要求书限定的范围之内。