专利名称：一种神经细胞诱导剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及促进胚胎干细胞分化为神经细胞的诱导剂；该诱导 剂的分子结构；该类诱导剂作为药物化合物诱导胚胎干细胞成为神经细胞的方法；应用该 诱导剂分化得到的神经干细胞植入模型动物脑内治疗阿尔茨海默病的用途。
背景技术：
胚胎干细胞是一种具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞，是一种独特的生物 资源。应用明确的定向诱导剂可以诱导胚胎干细胞分化成为多种类型的功能细胞，进而进 行细胞移植治疗或者相关药物的筛选。胚胎干细胞分化为神经细胞可用于神经系统疾病的 机制研究、细胞移植治疗和神经系统治疗药物的筛选，有潜在的社会和经济价值。但是，目 前还很缺乏高效的神经细胞诱导剂。 全反式维脯酰胺(N-all-trans-retinoyl-L-proline， ATRP)是基于全反式维甲 酸和芬维A胺结构设计的化合物。纯化的ATRP具有抑制肝癌细胞转移的作用。神经细胞 诱导分化方面的作用尚未有报道。 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)，又名老年性痴呆(senile dementia), 是一种常见于老年人的以进行性痴呆为特征的大脑退行性变性疾病，1907年由德国精神病 学、神经解剖学专家Alois Alzheimer首次描述并命名。阿尔茨海默病的主要病理表现为 神经元细胞外有大量老年斑、神经元细胞内有神经纤维缠结，这些病改变主要由淀粉样蛋 白沉积和tau蛋白异常磷酸化引起的，主要出现在Entorhinal皮质和海马回，同时病变部 位的神经元轴突与树突退化、神经元凋亡。阿尔茨海默病在发达国家已经成为仅次于心血 管病、肿瘤和卒中而位居第4位的致死原因。 研究显示，神经干细胞具有自我更新及产生多种类型神经细胞的能力，为神经系 统疾病的细胞移植治疗提供了细胞来源。体外培养的神经干细胞具有以下优点(l)在可 控制的培养条件下实现快速体外扩增，满足移植所需的细胞数量。(2)根据拟移植部位的细 胞类型及细胞结构特异性，在体外使神经干细胞分化成为受者部位细胞类型与构成相似的 细胞群体后再进行移植。也就是说为了满足特殊部位移植的需要，可事先在体外对供者细 胞进行"裁剪加工"，使之定向分化，能更容易整合入靶组织，提高移植物存活率。(3)利用 神经干细胞可低温冻存，而且复苏后仍能维持原来的生物学性征这些特点，可构建各种不 同类型的神经干细胞库。(4)神经干细胞可作为"治疗性基因"的载体，对损伤或病变部位 施行基因治疗，以实现外源性治疗基因的准确定位，高效表达。(5)神经干细胞是未分化的 原始细胞，移植后与宿主发生的排斥反应较小，有利于移植神经干细胞长期成活并与宿主 细胞更好的融合。移植外源性神经干细胞，既可以直接进行神经干细胞移植；也可以利用细 胞因子等进行诱导之后再将其移植；还可以对神经干细胞进行基因修饰后再进行移植。
神经干细胞用于神经退变性疾病替代治疗的设想始于病变较为局限的帕金森氏 病(Parkinson' s disease,PD)、亨庭顿氏病(Huntington' s disease,HD)等，并在实验中 取得了较为理想的效果。外源性多分化潜能的神经干细胞(小鼠或大鼠)移植脑内后，可以在神经系统良好的存活、大量增殖并迁移到不同部位分化为相应的神经细胞。神经干细 胞具有的这种广泛迁移的特性，使其移植替代治疗病变较为广泛的AD成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种神经细胞的诱导剂，具体涉及式I的化合物全反式维脯 酰胺(简称ATRP)在促进胚胎干细胞诱导分化为神经细胞中的用途，及其诱导分化得到的 神经干细胞在治疗阿尔茨海默病模型小鼠中的应用。 本发明所述的诱导剂通过促进信号分子ERK的磷酸化而加速胚胎干细胞向神经
细胞分化；诱导分化得到的神经干细胞通过立体定位植入阿尔茨海默病模型小鼠脑内可以
明显改善治疗小鼠的学习记忆功能。
(I )本发明的目的通过下述技术方案实现 通过细胞学、组织化学、分子生物学和生物化学实验对式I的化合物(ATRP)促进
ERK磷酸化的作用及其促进胚胎干细胞诱导分化的作用进行分析；通过细胞学、组织化学
和动物行为学实验对神经干细胞治疗阿尔茨海默病模型小鼠进行分析。 结果显示，ATRP在胚胎干细胞分化早期可以显著地促进ERK的磷酸化，胚胎干细
胞的标志性分子加速丢失，而神经前体细胞、神经干细胞及神经元的标志性分子均提前检
出；应用ERK信号通路的抑制剂可以阻断ATRP的促进胚胎干细胞分化为神经细胞的功能，
从正反两方面证实了 ATRP通过促进ERK的磷酸化发挥作用；诱导分化得到的神经干细胞通
过立体定位植入阿尔茨海默病模型小鼠脑内可以明显改善模型小鼠的学习记忆功能。 进一步，本发明所述的化合物可制备促进胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的药
物，其所诱导分化得到的神经干细胞可制备治疗阿尔茨海默病药物。
图1是RT-PCR结果显示ATRP促进0ct4mRNA表达加速下调。
图2是Western blot结果显示ATRP促进0ct4蛋白质表达加速下降。
图3是细胞免疫荧光结果显示ATRP促进0ct4阳性的胚胎干细胞加速减少。
图4是FACs检测结果显示ATRP促进Soxl^阳性的神经前体细胞提前出现。
图5是细胞免疫荧光结果显示ATRP促进Sox严P阳性的神经前体细胞提前出现。
图6是RT-PCR结果显示ATRP促进神经前体细胞和神经干细胞的标志(Pax6、 Nestin、BLBP、Prominin、01ig2、Musashi)、神经元的标志(Tujl、 M即2、 NCAM)提前出现。
图7是细胞免疫荧光结果显示ATRP促进Nestin阳性的神经干细胞提前出现。
图8是Western blot结果显示ATRP促进未成熟神经元的标志Tujl提前表达。
图9是细胞免疫荧光结果显示ATRP促进MAP2阳性的神经元和GFAP阳性的胶质 细胞提前出现。 图10是Western blot结果显示在胚胎干细胞分化早期，ATRP促进ERK的磷酸化。 图11是RT-PCR结果显示ATRP促进ERK的靶基因Elkl提前表达。 图12是细胞免疫荧光结果显示使用ERK信号通路的抑制剂PD0325901和
PD184352可以显著阻断ATRP所诱导的Soxl^阳性的神经前体细胞的出现。 图13是FACs检测结果显示使用ERK信号通路的抑制剂PD0325901和PD184352
可以显著阻断ATRP所诱导的SoxlGFP阳性的神经前体细胞的出现。 图14是细胞免疫荧光结果显示获得的神经干细胞呈神经干细胞特异性标志 Nestin阳性。 图15是细胞免疫荧光结果显示神经干细胞能够分化为表达MAP2的神经元和表达 GFAP的神经胶质细胞。 图16是Morris水迷宫测试指标-一 潜伏期治疗后模型小鼠能够更快地找到站 台° 图17是Morris水迷宫测试指标-一III象限时间百分比治疗后模型小鼠在站台 所在象限游泳时间明显长于未治疗模型小鼠。 图18是Morris水迷宫测试第15天去除站台，治疗后模型动物在中心区域的游泳 时间明显长于未治疗模型小鼠。
具体实施例方式
下面结合实验例对本发明进一步详细描述但不限制本发明。
以下实验中，所需物品说明 (1)所用胚胎干细胞为46C胚胎干细胞(在分化为神经前体细胞时表达Sox严P荧 光)，购于英国爱丁堡大学干细胞中心； (2) 46C胚胎干细胞的培养液成分为GMEM(Sigma公司)含2mM谷氨酰胺(Gibco 公司)、0.001% P-巯基乙醇(Gibco公司)、1X非必需氨基酸(Gibco公司)，10%胎牛血 清和2000单位/毫升重组人LIF(R&D公司)； (3)46C胚胎干细胞的分化培养液(N2B27)成分为含1 XN2 (Gibco公司)的DMEM/
F12 (Gibco公司)与含IX B27 (Gibco公司)的Neurobasal (Gibco公司)1 : 1混合； (4)细胞培养皿购于Nunc公司； (5)细胞培养皿包被用明胶购于Sigma公司； (6)细胞消化用胰酶购于Gibco公司； (7)无水乙醇购于国药集团； (8) ERK信号通路的抑制剂PD0325901和PD184352购于Calbiochem公司；
(9)胚胎干细胞的培养方法46C胚胎干细胞接种于0. 1 %明胶包被的细胞培养皿 上，隔天换液，生长至90%融合时传代； (10)胚胎干细胞的分化培养的方法将46C细胞胚胎干细胞以lX10Vcm2 的密度接种于O. 1%明胶包被的细胞培养皿上黏附培养，以N2B27作为培养液，在无 ATRP[N2B27+0 (对照)或N2B27+0. 02 % ethanol (溶剂对照)]或有ATRP [N2B27+10—6M
5ATRP (实验组)]的条件下生长分化，隔天换液； (11)阿尔茨海默病模型小鼠(Mo/HuAPPswePSldE9双转基因小鼠)购于Johns Hopkins大学； (12)立体定位注射仪购于Narishige公司，Morris迷宫购于上海吉量生物技术公 司。 实施例l ATRP对胚胎干细胞自我更新状态的影响实验
采用下述三种方法进行检测 (1) RT-PCR检测胚胎干细胞分子标志0ct4的mRNA表达水平
收集46C胚胎干细胞样品和第1、3、5天的分化细胞样品；用TRIzol (Invitrogen 公司)、DNase I和吸附柱(RNeasy MinElute Cleanup, Qiagen公司)获得无DNA污染的总 RNA ;用逆转录酶匪LV (Invitrogen公司)将RNA逆转录为cDNA ;用PCR试剂盒(申能博彩 公司)以cDNA为模板进行PCR反应；在2%的琼脂糖凝胶上进行DNA电泳；用凝胶成像系 统(Bio-Rad公司)采集电泳图像，结果见附图1 ; (2) Western blot检测胚胎干细胞分子标志0ct4的蛋白质表达水平 收集46C胚胎干细胞样品和第5天的分化细胞样品；用裂解液裂解(裂解液
成分20mM Tris-HCl， pH 7. 4，2% Triton X_100， 10mM EDTA，5mMNaF and lmM sodium
orthovanadate);加样于5%聚丙烯酰胺凝胶(浓縮胶)和12%聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)
上进行蛋白质电泳；电泳后用硝酸纤维素膜(Pall公司)转膜；5%脱脂奶粉室温封闭1小
时；抗0ct4抗体(Santa Cruz公司)1 : 1000稀释于5%脱脂奶粉，孵育硝酸纤维素膜4°C
过夜；二抗孵育后，ECL法发光；用凝胶成像系统(Bio-Rad公司)采集图像，结果见附图2; (3)细胞免疫荧光检测胚胎干细胞分子标志0ct4的蛋白质表达情况 46C胚胎干细胞分化培养3天；用4%多聚甲醛固定；以1 : 500抗0ct4抗体稀释
液4t:孵育过夜；二抗及Hoechst33342染核染料(Sigma公司)孵育后，在倒置荧光显微镜
下观察，结果见附图3。 以上结果显示ATRP加速胚胎干细胞的标志性分子0ct4的丢失，胚胎干细胞发生 分化。 实施例2 ATRP对胚胎干细胞神经分化的影响实验
采用下述方法进行检测 (l)FACs检测分化得到的Sox严P阳性的神经前体细胞比例 将分化不同时间的细胞用0. 05%的胰酶消化制成单细胞悬液；在流式细胞仪上 进行GFP荧光的检测，结果见附图4 ; (2)细胞免疫荧光检测分化得到的Soxl^阳性的神经前体细胞分布情况
46C胚胎干细胞分化培养3天；0. 01M PBS洗三次后，直接置于倒置荧光显微镜下 观察，结果见附图5; (3) RT-PCR检测神经前体细胞和神经干细胞的标志(Pax6、 Nestin、 BLBP、
Prominin、01ig2、Musashi)、神经元的标志(Tujl、 Map2、 NCAM)的mRNA表达水平 收集46C胚胎干细胞样品、成年小鼠大脑组织和第1、3、5、10天的分化细胞样品；
总RNA获得方法、逆转录方法及PCR方法同前，结果见附图6 ; (4)细胞免疫荧光检测Nestin阳性的神经干细胞分布情况
46C胚胎干细胞分化培养3天；用4%多聚甲醛固定；以1 : 200抗Nestin抗体 (Chemicon公司)稀释液4t:孵育过夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置荧光显微镜下 观察，结果见附图7; (5) Western blot检测未成熟神经元的标志Tujl的表达情况 收集46C胚胎干细胞样品和第7、9、11天的分化细胞样品；用裂解液裂解(裂解
液成分20mM Tris-HC1， pH 7.4，2% Triton X_100， 10mM EDTA，5mM NaF and lmM sodium
orthovanadate);加样于5%聚丙烯酰胺凝胶(浓縮胶)和12%聚丙烯酰胺凝胶(分离胶)
上进行蛋白质电泳；电泳后用硝酸纤维素膜(Pall公司)转膜；5%脱脂奶粉室温封闭1小
时；抗Tujl抗体(R&D公司)1 : 200稀释于5%脱脂奶粉，孵育硝酸纤维素膜4。C过夜；二
抗孵育后，ECL法发光；用凝胶成像系统(Bio-Rad公司)采集图像，结果见附图8 ; (6)细胞免疫荧光检测MAP2阳性的神经元和GFAP阳性的胶质细胞分布情况 46C胚胎干细胞分化培养9和11天；用4X多聚甲醛固定；以1 : 200抗MAP2抗
体(Sigma公司)稀释液和1 : 400抗GFAP抗体(Chemicon公司)稀释液4。C孵育过夜；
二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置荧光显微镜下观察，结果见附图9。 以上结果显示ATRP促进神经前体细胞、神经干细胞、神经元和胶质细胞的标志性
分子的提前出现，促进了胚胎干细胞向神经细胞的分化。 实施例3胚胎干细胞分化早期ATRP对ERK磷酸化的影响实验 采用下述方法进行检测 (1) Western blot检测在胚胎干细胞分化早期ERK的磷酸化水平
收集46C胚胎干细胞分化12小时的细胞样品；用裂解液裂解(裂解液成 分20mM Tris-HCl， pH 7.4，2 % Triton X_100，10mM EDTA，5mM NaF andlmM sodium orthovanadate);加样于5%聚丙烯酰胺凝胶(浓縮胶)和12%聚丙烯酰胺凝胶(分离 胶)上进行蛋白质电泳；电泳后用硝酸纤维素膜(Pall公司)转膜；5%脱脂奶粉室温封 闭1小时；抗ERK抗体(Cell Signaling公司)或抗磷酸化ERK抗体(Cell Signaling公 司)l : 500稀释于5X脱脂奶粉，孵育硝酸纤维素膜4t:过夜；二抗孵育后，ECL法发光；用 凝胶成像系统(Bio-Rad公司)采集图像，结果见附图10 ; [OO74] (2) RT-PCR检测ERK的靶基因Elkl的表达情况 收集46C胚胎干细胞样品、成年小鼠大脑组织和第1、3、5、10天的分化细胞样品； 总RNA获得方法、逆转录方法及PCR方法同前，结果见附图11。 以上结果显示胚胎干细胞分化早期，ATRP促进ERK的磷酸化，进而促进其耙基因 Elkl的表达。 实施例4 ERK信号通路的抑制剂对ATRP促神经诱导功能的影响实验
采用下述方法进行检测 (1)细胞免疫荧光检测使用ERK信号通路的抑制剂PD0325901和PD184352后 Sox严P阳性的神经前体细胞的分布情况 46C胚胎干细胞在ATRP和ERK信号通路的抑制剂同时存在情况下分化培养116小 时；0.01M PBS洗三次后，直接置于倒置荧光显微镜下观察，结果见附图12 ;
(2)FACs检测使用ERK信号通路的抑制剂PD0325901和PD184352后SoxlGFP阳性 的神经前体细胞比例
将在ATRP和ERK信号通路的抑制剂同时存在情况下分化92小时的细胞用0. 05% 的胰酶消化制成单细胞悬液；在流式细胞仪上进行GFP荧光的检测，结果见附图13。
以上结果显示ERK信号通路的抑制剂可以阻断ATRP的促神经诱导功能。
实施例5神经干细胞的获得与鉴定
(1) 46C胚胎干细胞单层贴壁培养 将46C胚胎干细胞以lOVcm2度接种于细胞培养皿上，用N2B27作为培养液；
(2)神经干细胞的出现和筛选 培养6天后，以PBS消化细胞，克隆化密度接种于细胞培养皿上，仍用N2B27作为 培养液；培养1天后，荧光显微镜下观察出现大范围Soxl^绿色荧光，表明有大量神经前体 细胞存在，改用含有EGF和bFGF各lOng/ml的N2B27作为培养液，并用嘌呤霉素筛选神经 干细胞； (3)神经干细胞的克隆化培养 筛选2天后，用含有EGF和bFGF的N2/B27作为培养液培养2周，挑出克隆，用含 有EGF和bFGF的N2/B27作为培养液扩增神经干细胞克隆，获取克隆化的神经干细胞；
(4)神经干细胞的鉴定 1)细胞免疫荧光鉴定神经干细胞呈特异性标志Nestin阳性
用4%多聚甲醛固定神经干细胞；以1 : 200抗Nestin抗体(Chemicon公司)稀 释液4t:孵育过夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置荧光显微镜下观察，结果见附图 14 ; 2)细胞免疫荧光鉴定神经干细胞的分化潜能 在N2B27培养液中培养得到的神经干细胞一周；用4 %多聚甲醛固定细胞；以 1 : 200抗MAP2抗体(Sigma公司)稀释液和1 : 400抗GFAP抗体(Chemicon公司)稀释 液4t:孵育过夜；二抗及Hoechst33342孵育后，在倒置荧光显微镜下观察，结果见附图15。
以上结果显示成功获得神经干细胞，并且该神经干细胞能够分化为表达MAP2的 神经元和表达GFAP的神经胶质细胞。 实施例6神经干细胞植入阿尔茨海默病模型小鼠及其对动物认知能力的影响实 验 (1)神经干细胞植入阿尔茨海默病模型小鼠 1)所选动物8月龄雄性小鼠，每只体重约30-35g 2)注射靶位右侧脑室 3)注射细胞数2. OiU，" 105细胞 (2)Morris迷宫测试检测动物的认知能力 细胞植入6周后，用Morris迷宫对实验动物进行为期15天的行为学测试，检测了 潜伏期、III象限时间百分比和第15天的中心区域时间百分比等指标，结果见附图16-18。 注III象限为站台所在象限。 以上结果显示神经干细胞脑内移植可以明显改善阿尔茨海默病模型小鼠的学习 记忆能力。
权利要求
一种神经细胞诱导剂，其特征在于含有式I的化合物，F2008102080861C0000011.tif
2. —种诱导胚胎干细胞成为神经细胞的方法，其特征在于采用权利要求1所述的化合 物通过细胞学、组织化学、分子生物学和生物化学实验，对所述的化合物促进ERK磷酸化的 作用及其促进胚胎干细胞诱导分化的作用进行分析；通过细胞学、组织化学和动物行为学 实验对神经干细胞治疗阿尔茨海默病模型小鼠进行分析，从正反两方面证实所诱导的胚胎 干细胞成为神经细胞。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的化合物在制备促进胚胎干细胞诱导 分化为神经细胞中的用途。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的诱导分化得到的神经干细胞在制备 治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及促进胚胎干细胞分化为神经细胞的诱导剂；该诱导剂的分子结构；该类诱导剂作为药物化合物诱导胚胎干细胞成为神经细胞的方法；应用该诱导剂分化得到的神经干细胞植入模型动物脑内治疗阿尔茨海默病的用途。经动物实验，结果从正反两方面证实了本发明诱导剂能通过促进ERK的磷酸化发挥作用；诱导分化得到的神经干细胞能通过立体定位植入阿尔茨海默病模型小鼠脑内可以明显改善模型小鼠的学习记忆功能。本发明的化合物进一步可制备促进胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的药物，其所诱导分化得到的神经干细胞可制备治疗阿尔茨海默病药物。
文档编号A61P25/28GK101768569SQ20081020808
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者吴兴中, 宋后燕, 陆建峰 申请人:复旦大学