专利名称：药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法，尤其一种用银杏内酯B诱导神经干细胞增殖和分化的方法及其应用。
神经干细胞是具有自我增殖和自我更新的属性，在体外它能在分裂原(mitogen)的作用下不断增殖，并维持干细胞的特征。现应用的分裂原主要包括表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维生长因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)。有研究表明EGF和bFGF可促进体外培养的神经干细胞增殖，这些细胞可传40-50多代后仍保持干细胞的特性。近年来的研究揭示，成年啮齿类和灵长类动物体内仍然可通过神经干细胞分化形成新的神经元。也有研究证实成人脑组织中存在有神经干细胞。神经干细胞既可在体外被上述生长因子诱导而增殖，并保持分化成神经元或胶质细胞的潜能，移植体内后又能在宿主的神经组织中存活、整合及分化。我们也将培养的神经干细胞移植到大鼠脊髓损伤处，结果发现神经干细胞不但能存活和迁移，而且分化为神经元的数量比对照组多。这提示移植的神经干细胞或在体内自身的神经干细胞可替代受损伤的或死亡的神经元，重建原有的神经元回路，起到神经传导通路的中断作用，修复受损伤的中枢神经结构和功能。
银杏叶提取物(Extract of Ginkgo bilobo，EGb)是从银杏科植物叶子中经多步骤分离、纯化获得的一种混合物，成份复杂，其主要有效成份为黄酮糖类和烯内酯类。已知前者具有清除氧自由基功能，而后者中的内酯B是血小板活化因子受体的专一拮抗剂。目前国内、外都有EGb的药剂，主要用于防治心血管系统疾病。最近国内、外也用于治疗老年性痴呆症(Alzheimer’s disease，AD)等神经退行性疾病，并取得一定的疗效。银杏内酯B能否促进神经干细胞分化为神经元，在国内外未见正式文献报导，更未研究银杏内酯B的这种作用是否有量效关系。
本发明的目的是克服现有研究方法上的不足，设计一种应用银杏内酯B促进体内外神经干细胞(分布在中枢神经内)分化为神经元的方法，为临床促进受损伤的中枢神经结构和功能修复和药物新应用提供指导。
本发明的基本方案包括(1)将银杏内酯B直接作用体外培养的神经干细胞，使神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞。
(2)研究以不同浓度的银杏内酯B直接作用体外培养的神经干细胞，在不同时间观察神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的情况。
(3)进一步，将不同浓度的银杏内酯B注射到动物体内，观察银杏内酯B是否能诱导中枢神经本身的神经干细胞增殖及分化为神经元和神经胶质细胞，替换受损伤的细胞或死亡的细胞，从而更好地促进受损伤的中枢神经结构和功能修复。
所述的银杏内酯B是血小板活化因子受体的专一拮抗剂，能促进培养的神经干细胞分化为神经元。神经干细胞是指神经系统中相对未分化的、具有增殖和分化潜能的细胞，可从发育中甚至成年的中枢神经内能分离出来。我们是从新生SD乳鼠的海马获取神经干细胞；也观察到成年SD大鼠大脑侧脑室室管膜、海马和脊髓中央管室管膜有神经干细胞。
本发明的优点显著。本研究选择一种中药成分来诱导体内、外神经干细胞分化为神经元和神经胶质细胞，替换受损伤的细胞或死亡的细胞。对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病如脊髓创伤进行防治基础性研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。本研究集中力量进行系统的工作，在分子和细胞水平上加强对中枢神经创伤后的细胞治疗和细胞替换等方面的研究。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展，都具有重要意义。本发明将使我国的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。
下面通过具体实施例对本发明作详尽的描述。
银杏内酯B是南京中国药科大学中药学院天然药物化学教研室提取的产品。
体外培养神经干细胞及其分化的细胞的制备方法如下选用新生的SD乳鼠，断头取出海马，制成分离细胞悬液。在基础培养液和非血清辅助培养液的混合培养液条件下进行培养，培养液中加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，采取悬浮培养方式放置于培养箱中培养。7～10天后将原代培养所形成的神经干细胞克隆球分离，进行传代培养。第2代培养7～10天后，取部分细胞进行鉴定。收集第2代克隆的神经干细胞，并接种在24孔培养板中。实验分成四组对照组，20μg/ml银杏内酯B组，40μg/ml银杏内酯B组和60μg/ml银杏内酯B组。于体外分别培养7d和14d后，用免疫细胞化学方法检测神经元的特异性标记物、生长相关蛋白、星形胶质细胞特异性标记物和少突胶质细胞特异性标记物的表达，并计数分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的百分率。
体内诱导神经干细胞分化的方法如下SD雌性大鼠20只，分为对照组和实验组，每组5只SD大鼠。
脊髓半横断模型的制备和注射BrdU及银杏内酯B用1％戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉大鼠，正中切开背部皮肤，在手术显微镜做脊髓右侧半横断。术后经腹腔注射BrdU(50mg/kg)，2次/天，连续注射10天。术后实验组每天经腹腔注射银杏内酯B 50μg、100μg和150μg三种剂量。对照组不注射银杏内酯B。
本发明详细的具体操作技术说明如下1.体外诱导神经干细胞分化(1)神经干细胞的培养在无菌条件下取出SD新生鼠大脑，放入D-Hank’s液中，剔除脑膜，分离出海马。将海马剪碎置入离心管中，以1000r/min离心5min，吸去上清液，再加入0.25％胰蛋白酶消化10min(37℃)，用含10％胎牛血清的培养基终止消化。随后离心5min，吸去上清液，加入DMEM/F12(含bFGF 20ng/ml，B27 20μl/ml)的培养液，用吸管吹打成单细胞悬液，过滤，细胞计数。以1×105/ml的细胞密度移入培养瓶中培养，每隔3d半量置换培养基。培养7～9d后，机械分离克隆球进行传代。
(2)银杏内酯B对神经干细胞的诱导分化将培养的第二代神经干细胞收集，以2×105/cm2的细胞密度接种于预先用100μg/ml多聚赖氨酸处理过的两块24孔培养板各孔中的盖玻片上。每块培养板分对照组、20μg/ml(培养液)银杏内酯B组、40μg/ml(培养液)银杏内酯B组和60μg/ml(培养液)银杏内酯B组，每组6孔。对照组培养液用DMEM/F12(Gibco公司)，另加10％胎牛血清配制。银杏内酯B组的培养液是在对照组培养液中加入了银杏内酯B，浓度分别为20μg/ml，40μg/ml和60μg/ml。将培养板置饱和湿度、5％CO2培养箱37℃培养。每隔3d半量置换培养液，培养7d和14d终止。
(3)分化后的细胞鉴定在分别培养7d和14d后，取出24孔培养板各孔中的盖玻片。用4％多聚甲醛(以0.1M PB制备，pH＝7.2～7.4)固定30min，0.01M PBS彻底冲洗后。各组做免疫荧光细胞化学染色，检测神经丝蛋白(NF200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、少突胶质细胞特异性蛋白(Oligodendrogin)和生长相关蛋白(GAP-43)(4)细胞计数在10×20荧光显微镜下，对免疫荧光细胞化学染色NF阳性的细胞进行计数(以0.25mm2区域作为计数单位面积)。每组有6个培养神经干细胞的盖玻片，每个盖玻片上随机选4个计数单位面积，计数细胞总数和染色阳性细胞数及染色阳性细胞的百分率。计数单位面积内细胞核荧光阳性的细胞总数，NF染色和细胞核荧光标记的双阳性的细胞数，GFAP染色和细胞核荧光标记的双阳性细胞数和Nestin染色和细胞核荧光标记的双阳性细胞数。用x2进行检验。
(5)实验结果显示①神经干细胞的原代及传代培养和鉴定在原代培养神经干细胞7～9d后，可获得大量的呈悬浮生长、大小不一的克隆球。原代的克隆球经胰酶消化后将分离的细胞进行传代培养，又可形成新的细胞克隆球。这些克隆球经Nestin和BrdU抗体鉴定呈阳性染色，表明它们是神经干细胞，具有分裂增殖能力。
②银杏内酯B对神经干细胞诱导分化的结果银杏内酯B能促进培养的神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞。不同浓度的银杏内酯B实验组，神经干细胞分化为神经元的百分率都高于对照组(P＜0.05)，但不同浓度的银杏内酯B实验组之间没有显著差异(P＞0.05)。不同浓度的银杏内酯B实验组神经干细胞分化为星形胶质细胞的百分率都高于对照组(P＜0.05)，并随银杏内酯B浓度的增加而增高。
2.体内诱导神经干细胞分化(1)动物分组SD雌性大鼠(体重150～180g)20只，购自中山大学中山医学院实验动物中心。动物随机分为对照组和实验组，每组5只SD大鼠。
(2)制备脊髓半横断模型和注射BrdU及银杏内酯B1％的戊巴比妥钠(35～40mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠，正中切开背部皮肤，在手术显微镜下暴露T10～T13棘突和椎板，用咬骨钳撬掉椎板，暴露脊髓T12段，做脊髓右侧半横断。彻底止血后缝合肌肉和皮肤切口，并肌肉注射青霉素。术后所有动物经腹腔注射BrdU(50mg/kg)，2次/天，连续注射10天。术后实验组每天经腹腔注射银杏内酯B 50μg/180g、100μg/180g和150μg/180g三种剂量。对照组不注射银杏内酯B。
(3)灌注、固定和取材分别在7天、14天、21天和30天用1％戊巴比妥钠麻醉动物，4％多聚甲醛(以0.1M PB制备，pH＝7.2～7.4)固定液进行心脏灌流，取T8～L1脊髓节段，并在同一固定液中后固定4小时，置入30％蔗糖(以0.1M PB制备)液中，置4℃下至沉底，用恒温冰冻切片机做脊髓T11，T12和T13段的连续横切片，厚度为30μm。
(4)荧光免疫细胞化学双标法染色①0.01MPBS冲洗3次，每次5min。②0.2％TritonX-100，37℃，30min。③正常羊血清温育，37℃，20min。④滴加一抗(分别为BrdU、NF200、GFAP、Nestin、S-100和GAP-43)，37℃温育2小时。⑤0.01MPBS冲洗3×5min。⑥滴加生物素化二抗，37℃温育30min。⑦0.01MPBS冲洗3×5min。⑧滴加SABC复合液，37℃温育30min。⑨0.01MPBS冲洗3×5min。阴性对照，不加一抗用PBS代替。
(5)实验结果银杏内酯B能够促进受损伤中枢神经自身神经干细胞的增殖，并向神经元和少突胶质细胞分化，参与神经网络的重建，修复中枢神经的功能。
权利要求
1.一种药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法，其特征是将银杏内酯B作用培养的神经干细胞，诱导其分化为神经元和星形胶质细胞；应用银杏内酯B作用体内受损伤的中枢神经自身神经干细胞，诱导其分化为神经元和星形胶质细胞。
2.根据权利要求1所述的药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法，其特征是在体外培养应用的银杏内酯B浓度为20～60μg/ml。
3.根据权利要求1所述的药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法，其特征是神经干细胞的制备方法为选用新生1～2d的纯种SD乳鼠，断头取脑后分离出海马，经胰蛋白酶消化后制成分离细胞悬液，在基础培养基DMEM/F12和非血清辅助培养基B27的混合培养液条件下进行培养，培养液中加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，采取悬浮培养方式放置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养；7～10d后将原代培养所形成的神经干细胞克隆球用胰蛋白酶和EDTA混合液消化分离，进行传代培养；细胞培养过程每隔3天半保留换液1次。
4.根据权利要求1所述的药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法，其特征是该方法包括如下步骤(1)将培养的第二代神经干细胞收集，以2×105/cm2的细胞密度接种于预先用100μg/ml多聚赖氨酸处理过的两块24孔培养板各孔中的盖玻片上；每块培养板分对照组、20μg/ml(培养液)银杏内酯B组、40μg/ml(培养液)银杏内酯B组和60μg/ml(培养液)银杏内酯B组，每组6孔；对照组培养液用DMEM/F12，另加10％胎牛血清配制。银杏内酯B组的培养液是在对照组培养液中加入了银杏内酯B，浓度分别为20μg/ml，40μg/ml和60μg/ml；将培养板置饱和湿度、5％C02培养箱37℃培养；每隔3d半量置换培养液，培养7d和14d终止；(2)在分别培养7d和14d后，取出24孔培养板各孔中的盖玻片；用4％多聚甲醛(以0.1M PB制备，pH＝7.2～7.4)固定30min，0.01M PBS彻底冲洗后；各组做免疫荧光细胞化学染色，检测神经丝蛋白(NF200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、少突胶质细胞特异性蛋白(Oligodendrogin)和生长相关蛋白(GAP-43)；(3)在10×20荧光显微镜下，对免疫荧光细胞化学染色NF阳性的细胞进行计数(以0.25mm2区域作为计数单位面积)；每组有6个培养神经干细胞的盖玻片，每个盖玻片上随机选4个计数单位面积，计数细胞总数和染色阳性细胞数及染色阳性细胞的百分率；计数单位面积内细胞核荧光阳性的细胞总数，NF染色和细胞核荧光标记的双阳性的细胞数，GFAP染色和细胞核荧光标记的双阳性细胞数和Nestin染色和细胞核荧光标记的双阳性细胞数；用x2进行检验。
5.药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法的应用，其特征是在体内应用银杏内酯B作用受损伤的脊髓自身神经干细胞，诱导其增殖和分化为神经元和星形胶质细胞。
6.根据权利要求5所述的药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法的应用，其特征是包括如下步骤(1)1％的戊巴比妥钠(35～40mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠，正中切开背部皮肤，在手术显微镜下暴露T10～T13棘突和椎板，用咬骨钳撬掉椎板，暴露脊髓T12段，做脊髓右侧半横断；彻底止血后缝合肌肉和皮肤切口，并肌肉注射青霉素；术后所有动物经腹腔注射BrdU(50mg/kg)，2次/天，连续注射10天；术后实验组每天经腹腔注射银杏内酯B 50μg/180g、100μg/180g和150μg/180g三种剂量；对照组不注射银杏内酯B；(2)分别在7天、14天、21天和30天用1％戊巴比妥钠麻醉动物，4％多聚甲醛(以0.1M PB制备，pH＝7.2～7.4)固定液进行心脏灌流，取T8～L1脊髓节段，并在同一固定液中后固定4小时，置入30％蔗糖(以0.1M PB制备)液中，置4℃下至沉底，用恒温冰冻切片机做脊髓T11，T12和T13段的连续横切片，厚度为30μm；(3)荧光免疫细胞化学双标法染色①0.01MPBS冲洗3次，每次5min；②0.2％TritonX-100，37℃，30min；③正常羊血清温育，37℃，20min；④滴加一抗(分别为BrdU、NF200、GFAP、Nestin、S-100和GAP-43)，37℃温育2小时；⑤0.01MPBS冲洗3×5min；⑥滴加生物素化二抗，37℃温育30min；⑦0.01MPBS冲洗3×5min；⑧滴加SABC复合液，37℃温育30min；⑨0.01MPBS冲洗3×5min；阴性对照，不加一抗用PBS代替。
全文摘要
本发明涉及一种药物诱导神经干细胞增殖和分化的方法。将银杏内酯B作用体内外的神经干细胞，诱导其分化为神经元细胞和星形胶质细胞。本发明在细胞水平上加强对中枢神经创伤后的保护机制、替换受损伤的神经元，参与神经网络的重建，修复中枢神经的功能。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展有重要意义。
文档编号A61K31/365GK1446907SQ0311424
公开日2003年10月8日 申请日期2003年4月18日 优先权日2003年4月18日
发明者曾园山 申请人:中山大学中山医学院科技开发中心, 曾园山