一种提高微生物生物量及油脂产量的方法与流程

本发明涉及微藻和酵母生物发酵培养技术，特别涉及一种通过混合培养蛋白核小球藻及产油酵母提高生物量及油脂产量的方法。

背景技术：

社会经济的不断发展带来了化石能源的日益枯竭和环境污染等诸多问题。随着油品供需矛盾的日益突出，多渠道开发可再生资源成为必然趋势。作为一种新型生物能源，生物柴油的优越性近年来日益受到人们的关注。微生物油脂又称单细胞油脂，其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸等饱和与不饱和的脂肪酸为主。微生物发酵利用底物范围较广，可直接利用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和纤维素水解液等，不但可以提供新的油脂生产方法，而且可以利用廉价废弃生物质，降低油脂生产成本，保护环境。

微生物的混合培养在自然界中十分常见。作为两种重要的产油微生物，微藻、酵母在其生长过程中具有不同的特点。已有研究表明，微藻、酵母两种产油微生物在同一培养体系中可以表现出互利共生的关系。与单独培养相比，混合培养在pH调节、溶解氧平衡等培养条件方面更有利于微生物生长和油脂积累。

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)都是具有潜力的产油微生物。研究表明，这两种微生物在一定的条件下可以互利共生，达到增加生物量和油脂产量的目的。充分利用混合培养模式，优化培养条件，以提高生物量和油脂产量具有重要意义。

现有的微生物油脂生产技术是将不同种类的微生物各自进行培养，普遍存在着成本高、微生物细胞生长慢、油脂含量低等缺点。酵母的发酵过程需要大量的碳源，且释放大量的CO₂气体会带来环境问题，而微藻培养过程中需要加强光照或补充CO₂气体来提高油脂产量(高C/N下)。含油微生物培养过程中对于不同类型的含油微生物之间的混合协同培养方式来实现高效油脂生产等方面的研究较少。

技术实现要素：

为了克服现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种利用混合培养模式，大大提高微生物生物量和油脂产量的方法，且该方法相对简便，有效降低能耗和生产成本，在利用产油微生物进行生物原料油制备方面，具有重要的应用价值。

为解决上述问题，采用的技术方案如下。

一种提高微生物的生物量及油脂产量的方法，包括如下步骤：

1)活化培养：分别将小球藻和两种产油酵母细胞接种于培养基中活化培养至对数生长期并作为种子液；

2)分别将小球藻和产油酵母按不同比例接种到装有Basal培养基(酵母膏作为N源替换NaNO₃)的摇瓶中，置于光照培养箱中，28℃、150r/m、光强为100μmol m^-2s^-1培养7天。其中，Basal培养基成分为：

1.25g/L硝酸钠，1.25g/L磷酸二氢甲，1g/L七水合硫酸镁，0.5g/L EDTA，0.111g/L氯化钙，0.0498g/L七水合硫酸铁，0.004g/L六水硝酸钴，0.0119g/L二水钼酸钠，0.057g/L硼酸，0.04g/L七水硫酸锌，7.1mg/L一水氯化锰，7.85mg/L五水硫酸铜。

3)按小球藻细胞比酵母数3：1接种至含有1.6g/l酵母膏和含量不同葡萄糖的250ml BG11培养基中(无其他氮源和碳源)，培养基中含有不同的C/N比。初始藻细胞数为5×10⁵cells ml^-1。将接种后的摇瓶置于光照培养箱中，28℃、150r/m、光强为100μmol m^-2s^-1培养12天。

所述BG11培养基为：0.0524g/L三水合磷酸氢二甲，0.075g/L七水合硫酸镁，0.036g/L二水合氯化钙，0.006g/L柠檬酸，0.006g/L柠檬酸铁铵，0.001g/L EDTA二钠，2.86mg/L硼酸，1.86mg/L一水氯化锰，0.22mg/L七水硫酸锌，0.39g/L二水钼酸钠，0.08mg/L五水硫酸铜，0.05g/L六水硝酸钴。

4)将步骤2)、步骤3)培养结束后的微生物细胞离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末，用于测定评价生物质干重、总脂含量和脂肪酸含量。

优选的,步骤2)中，当蛋白核小球藻对粘红酵母接种比为3:1时，得到最大生物量干重浓度(17.33g/L)和总脂产量(3.12g/l)，此时油脂产率达到0.45g/l/d，是单独培养酵母细胞的4倍、单独培养微藻细胞的3倍以上。当蛋白核小球藻与热带假丝酵母酵母的接种比例为2：1时，可得到最大生物量干重(11.94g/l)和总脂肪产量(2.54g/l)，此时的油脂产率最高，达到0.36g/l/d，是单独培养的酵母和藻细胞的两倍。

优选的，步骤3)中，随着碳氮比的增加，微生物干粉中的总脂含量随之增加；当培养基中C/N为64时，混合培养微生物干粉总脂肪含量可达到40.55％，产率为206.67mg/l/d。混合培养的微生物干粉的脂肪酸成分符合生物燃料炼制的要求,总脂肪酸产率达到175.64mg/l/d，显著大于单独培养的微藻细胞，是单独培养的酵母细胞的两倍以上。

借由上述技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

1、本发明基于对蛋白核小球藻和产油酵母的混合培养研究，筛选出了最适混合培养的接种比例。生物量和油脂产量最佳，蛋白核小球藻对粘红酵母接种比为3:1，蛋白核小球藻微藻与热带假丝酵母酵母的接种比例为2：1时。

2、本发明筛选出了最适混合培养的C/N。当C/N为64时，蛋白核小球藻和粘红酵母的混合培养微生物干粉总脂肪含量可达到40.55％，产率为206.67mg/l/d。该混合培养的微生物干粉的总脂肪酸产率达到175.64mg/l/d，显著大于单独培养的微藻酵母，是单独培养的粘红酵母细胞的两倍以上。

3、与传统的单独培养方式相比，混合培养充分结合了两种产油微生物的互利共生的特点，缓解了培养过程中产生的不利因素，尤其在pH值和溶氧调节方面，能使混合培养体系在一定时间内维持一个相对稳定的环境。

4、本发明涉及的方法相对简便，有效降低能耗和生产成本，在利用产油微生物进行生物原料油制备方面，具有重要的应用价值。

附图说明

图1是单独培养和混合培养下蛋白核小球藻和粘红酵母的生物量浓度、总脂含量及产率。混1-3表示不同接种比例的混合培养(微藻对酵母)。

图2A-2C分别是单独培养和混合培养下蛋白核小球藻和粘红酵母显微照片。(A:混合培养；B蛋白核小球藻单独培养；C:酵母单独培养)。

图3是单独培养和混合培养下培养基中溶解氧浓度的变化。

图4是单独培养和混合培养下培养基中pH值的变化。

图5A-5I分别是单独培养和混合培养下蛋白核小球藻和粘红酵母尼罗红染色的荧光图片。(A,D,G:混合培养；B,E,H:微藻单独培养；C,F,I:酵母单独培养。红色荧光表示细胞内中性脂油滴)。

图6培养过程中微藻细胞和酵母细胞中性脂荧光变化及微藻细胞叶绿素荧光变化。

图7是单独培养和混合培养下蛋白核小球藻和热带假丝酵母的生物量浓度、总脂含量及产率。混1-3表示不同接种比例的混合培养(微藻对酵母)。

具体实施方式

以下通过具体较佳实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。

实施例1

一种提高微生物的生物量及油脂产量的方法，包括如下步骤：

1)活化培养：分别将小球藻和粘红酵母细胞接种于培养基中活化培养至对数生长期并作为种子液；

2)分别将小球藻和酵母按不同比例(1：1-3：1)接种到装有Basal培养基(酵母膏作为N源替换NaNO₃)的摇瓶中，置于光照培养箱中，28℃，150转，光强为100μmol m^-2s^-1培养7天；其中，Basal培养基成分为：

1.25g/L硝酸钠，1.25g/L磷酸二氢甲，1g/L七水合硫酸镁，0.5g/L EDTA，0.111g/L氯化钙，0.0498g/L七水合硫酸铁，0.004g/L六水硝酸钴，0.0119g/L二水钼酸钠，0.057g/L硼酸，0.04g/L七水硫酸锌，7.1mg/L一水氯化锰，7.85mg/L五水硫酸铜。

3)按小球藻细胞比酵母数3：1接种至含有1.6g/l酵母膏和含量不同葡萄糖的250ml BG11培养基中(去除氮源和碳源)，培养基中含有不同的C/N比，分别为16，32，48，64。初始藻细胞数为5×10⁵cells ml^-1。将接种后的摇瓶置于光照培养箱中，28℃，150转，光强为100μmolm^-2s^-1培养12天。所述BG11培养基为：0.0524g/L三水合磷酸氢二甲，0.075g/L七水合硫酸镁，0.036g/L二水合氯化钙，0.006g/L柠檬酸，0.006g/L柠檬酸铁铵，0.001g/L EDTA二钠，2.86mg/L硼酸，1.86mg/L一水氯化锰，0.22mg/L七水硫酸锌，0.39g/L二水钼酸钠，0.08mg/L五水硫酸铜，0.05g/L六水硝酸钴。

4)将步骤2)、步骤3)培养结束后的微生物细胞离心、洗涤和冷冻干燥后，即得到粉末，用于测定评价生物质干重、总脂含量和脂肪酸含量。

如下图1所示，不同微藻，所述微藻与酵母的接种比例为3：1时，可得到最大生物量干重浓度和总脂含量，分别为17.33g/L和17.99％，此时油脂产率达到0.45g/l/d，是单独培养酵母细胞的4倍，单独培养微藻细胞的3倍以上。

随着碳氮比的增加，微生物干粉中的总脂含量随之增加。

如下表1所示，当培养基中C/N不断增大时，混合培养的微生物干粉中总脂和生物量含量不断增加，当C/N为64时，混合培养的微生物干粉中总脂含量和生物量最大，可达40.55％。此时，油脂产量和产率分别为2.48g/l，206.67mg/l/d。

表1不同C/N对蛋白核小球藻及粘红酵母在混合培养和单独培养条件下生物量干重及油脂生产的影响

p<0.05,**p<0.01与蛋白核小球藻单独培养对比

#p<0.05##p<0.01与酵母单独培养对比

图2A-2C显示的是微藻酵母在混合培养和单独培养时的状态，藻细胞和酵母细胞相互围绕，可能存在着气体和物质交换。如图3所示，随着培养时间的延长，微藻单独培养组培养基中的溶解氧浓度不断增加，最后维持在160％左右。高浓度的溶氧会给微藻带来氧损伤。混合培养中微藻光合作用释放的氧气可被酵母细胞利用，因而使得混合培养体系处于一个平衡状态。如图4所示，混合培养很好的平衡了培养基中的酸碱物质，使得培养体系处于一个相对稳定的pH环境中。

图5A-5I直观的显示了在C/N为64时，微藻和酵母细胞内油脂积累的情况。混合培养条件下，微藻和酵母细胞均观察到了较强的红色荧光。如图6所示，随着微藻细胞中叶绿素的降低，中性脂荧光不断增加，最终达到微藻单独培养细胞的两倍以上。而混合培养的酵母细胞中性脂荧光在培养初期就显著增加，到第六天达到最大。随着培养时间的延长，中性脂荧光虽然有所下降，但在培养结束时仍大于单独培养组。

此外，如表2所示，混合培养能明显提高微生物干粉中脂肪酸含量。最终得到的微生物干粉中，总脂肪酸占总生物量干重的34.44％，占总脂比例的86.61％。总脂肪酸产率达到175.64mg/l/d，显著大于单独培养的微藻酵母，是单独培养的粘红酵母细胞的两倍以上。此外，脂肪酸成分中，C16、C18占主要比例，符合生物柴油炼制的要求。

表2单独培养和混合培养条件下微生物干粉的脂肪酸成分

实施例2

一种提高微生物的生物量及油脂产量的方法，包括如下步骤：

1)活化培养：分别将小球藻和热带假丝酵母细胞接种于培养基中活化培养至对数生长期并作为种子液；

2)分别将小球藻和热带假丝酵母按不同比例(1：1-3：1)接种到装有Basal培养基(酵母膏作为N源替换NaNO₃)的摇瓶中，置于光照培养箱中，28℃，150转，光强为100μmol m^-2s^-1培养7天；其中，Basal培养基成分为：

1.25g/L硝酸钠，1.25g/L磷酸二氢甲，1g/L七水合硫酸镁，0.5g/L EDTA，0.111g/L氯化钙，0.0498g/L七水合硫酸铁，0.004g/L六水硝酸钴，0.0119g/L二水钼酸钠，0.057g/L硼酸，0.04g/L七水硫酸锌，7.1mg/L一水氯化锰，7.85mg/L五水硫酸铜。

3)分别测定混合培养和单独培养的微生物生物量和总脂含量。

如图7所示，所述微藻与热带假丝酵母酵母的接种比例为2：1时，可得到最大生物量干重和总脂肪产量，分别是11.94g/和2.54g/l。此时的油脂产率最高，达到0.36g/l/d。本发明实施例中采用的检测方法可参照如下说明进行：

(一)微生物生物量浓度的测定如下方法：

取2mL微生物培养液，8000r/p10分钟，去上清液，用蒸馏水冲洗两次，去除上清液后置于烘箱中70℃，干燥24小时，称重并计算生物质干重(g/l)。

(二)微生物干粉中总脂含量的测定采用如下方法：

取20mg微生物粉末重悬于蒸馏水中，用液氮速冻，融化后添加提取液(氯仿/甲醇2：1v/v)并置于高速震荡仪中200r/m震荡30s，反复操作3次，8,000转离心10分钟，合并氯仿层。氮气吹干，称重并计算微生物粉末中的总脂含量。

(三)微生物干粉中脂肪酸组成分析采用脂肪酸甲酯化GC-MS法。分析采用HP 6890GC-MS(Agilent,USA)进行分析，配以5975内置型MSD和高效毛细管柱(DB-23,30mm×0.25mm,0.25μm)。

选用高纯氦气作为载气，流速为1ml/min。样品不分流，进样量为0.2μl。进样口温度为250℃，检测器温度为270℃。程序升温条件为：130℃保持1min，然后以5℃/min升高到200℃保持5min。质谱的质量扫描范围为33-400amu。各峰型的鉴定采用NIST05a谱库自动检索，对脂肪酸组分进行定性分析。定量分析采用150μg C19：0为内标，以面积归一化法测得各脂肪酸组分的相对含量，再根据各脂肪酸相对于C19：0内标的峰面积来计算各脂肪酸组分的绝对含量。

各脂肪酸占藻粉质量的百分数的计算公式如下：

脂肪酸(％干重)＝[脂肪酸(％总脂肪酸)/C19:0(％总脂肪酸)×150(μg)×10-3]/藻粉重量(mg)×100％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。