一种双齿围沙蚕抗肺癌多肽的制备方法与流程

文档序号:12412489阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种双齿围沙蚕抗肺癌多肽的制备方法,其特征在于,步骤如下:

(1)样品预处理:将双齿围沙蚕解冻后,清洗干净,匀浆,得到匀浆液;

(2)酶解:按照每克匀浆液加1mL纯净水的配比,将匀浆液与纯净水混匀,调节pH至11,加入碱性蛋白酶,酶解后得酶解液;

(3)超滤:酶解液灭活,离心,取上清液,经超滤获得分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五种组分的活性组分,MTT法筛选对肺癌细胞A549增殖抑制率最高的活性组分;

(4)阴离子交换层析:收集步骤(3)获得的对肺癌细胞A549增殖抑制率最高的活性组分,冷冻干燥,经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,梯度洗脱,在280nm进行检测,分别收集各洗脱峰并冷冻干燥,MTT法筛选对肺癌细胞A549增殖抑制率最高的阴离子交换层析产物;

(5)Sephadex G25凝胶层析:将步骤(4)获得的对肺癌细胞A549增殖抑制率最高的阴离子交换层析产物采用Sephadex G-25凝胶层析分离纯化,蒸馏水洗脱,在280nm进行检测,分别收集各洗脱峰并冷冻干燥,MTT法筛选对肺癌细胞A549增殖抑制率最高的Sephadex G25凝胶层析产物;

(6)高效液相色谱分离纯化:对步骤(5)获得的对肺癌细胞A549增殖抑制率最高的Sephadex G25凝胶层析产物经滤膜过滤后用采用反相高效液相色谱法分离纯化,收集主峰,冷冻干燥后获得双齿围沙蚕抗肺癌多肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)按照每克匀浆液加300U的加酶量加入碱性蛋白酶,50℃酶解6小时得酶解液。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析的分离条件为:pH 7.2、0.2mM的Tris-HCl缓冲溶液平衡柱子后,将样品配成250mg/mL,每次上样量为2mL,每次上样前过0.22μm的膜。

4.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤(5)蒸馏水洗脱的洗脱流速为1.1mL/min。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤(6)反相高效液相色谱法分离纯化的色谱条件:色谱柱:ZORBAX SB-C18分析型色谱柱;检测波长:280nm;流速:0.5mL/min;流动相A为含0.05%三氟乙酸的乙腈,流动相B为含0.05%三氟乙酸的超纯水,采用梯度洗脱方式:20%~100%A洗脱5~20min;平衡时:流动相A与流动相B的流动相体积比为20:80;柱温:25℃;自动进样,进样量:10μL。

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