专利名称：双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，尤其涉及-的克隆方法。
4中双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因(CYP4)
背景技术：
多毛类隶属于环节动物门，是广泛分布于海洋近岸和河口潮滩的优势底栖动物， 也是海洋生态系统能量流动和物质循环的重要环节。由于其具有体型大、生命周期长、行动缓慢、分布广泛，对许多持久性污染物具有较强的耐受性和生物利用性，因此一直作为海洋沉积环境污染评价的指示生物和毒理研究的模型动物。如沙蚕种群分布的生活环境常有石油烃等污染，一些沙蚕种群对石油烃(PHs)表现出较高的耐受能力并有一定的降解能力， Christensen等研究了沙蚕在芘暴露试验结束时，体内50%的芘发生代谢转化成水溶性物质，沙蚕暴露于杀虫剂类溴氰菊酯(DM)中的表现也极其敏感。双齿围沙蚕iPerinereis aibuhitensis)在辽东湾潮间带底栖生物中为优势种， 其细胞色素氧化酶基因序列在GenBank中已有记载，全长1857个碱基，其中，开放阅读框为 1446个碱基，序列如下
权利要求
1. 一种双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法，其特征在于按下列步骤进行a.提取及纯化双齿围沙蚕总RNA，合成cDNA第一链；b.应用一对引物通过聚合酶链式反应对双齿围沙蚕cDNA第一链进行扩增 所述正向引物5 ‘ -ATGTTTGARG⑶CAWGAMAC-3 ‘，所述反向引物5 ‘ -AATNTTGNCCHATRCARTT-3 ‘；c.应用5'RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行5' RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA5 ‘端序列；所述 5 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -GATTAGGGGCACTGGACACC-3 ‘； 所述 5 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -CCGCCAGCAACTCGTCAAGT-3 ‘；d.应用3'RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行3' RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA3 ‘端序列；所述 3 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -GCCCCTAATCAGCCGACAAC-3 ‘； 所述 3 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -GGGGGAAGACCATGATGAAT-3 ‘；e.将双齿围沙蚕cDNA5'端序列与双齿围沙蚕cDNA3‘端序列拼接，即获得双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因。
全文摘要
本发明公开一种双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法，是通过设计特异性片段扩增和RACE扩增的方法，从双齿围沙蚕体壁肌肉总RNA中克隆得到了双齿围沙蚕的细胞色素氧化酶基因，可利用实时荧光定量PCR技术检测双齿围沙蚕在受到持久性有机污染物胁迫下细胞色素氧化酶基因表达的规律，为探讨重金属对沙蚕细胞色素氧化酶基因表达、调控的作用机理提供依据，亦为筛选海洋沉积环境污染早期生态风险预测的分子生物标志物奠定基础，利于成本低、来源丰富的双齿围沙蚕在环境保护中广泛应用。
文档编号C12N15/53GK102286498SQ201110261349
公开日2011年12月21日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者何洁, 周一兵, 杨大佐, 王斌, 赵欢, 陈雪 申请人:大连海洋大学