双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19基因序列及其克隆方法

双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19基因序列及其克隆方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19（MMP19）基因序列及其克隆方法。双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19基因序列为SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。本发明首次从双齿围沙蚕中克隆到一种基质金属蛋白酶19基因，该序列cDNA全长1310bp，其中开放阅读框位于21-1118位核苷酸，编码365个氨基酸残基。双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19基因的成功克隆和测序，为进一步分析MMP19影响下生物抗逆能力，为MMP19其它功能的筛选及应用奠定了基础；也为利用MMP19基因对不同浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
【专利说明】双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19基因序列及其克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19 (MMP19)基因序列及其克隆方法。
【背景技术】
[0002]基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)是一类在结构上具有极大同源性，能降解多种细胞外基质(ECM)和基底膜蛋白质的内肽酶，因需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成:(I)疏水信号肽序列；(2)前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMP酶原被激活；(3)催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要；
(4)富含脯氨酸的铰链区；(5)羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。基质金属蛋白酶家族在人类的多种病理过程中表达，主要参与正常组织和异常组织的构建、修复，正常和病态细胞在体内的迁移、血管形成、炎症反应、伤口愈合、肿瘤侵袭和转移等过程。MMP几乎能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键作用，被认为是肿瘤侵润转移过程中主要的蛋白水解酶，因此MMP家族的 作用机理和功能研究备受关注。
[0003]由于MMP家族在进化上非常保守，在很多物种中都发现了它的同系物。目前MMP家族已分离鉴别出26种成员，编号分别为MMPl~26。在脊椎动物中发现了至少24种家族成员，由于它们之间互相联系功能非常复杂，所以它们在生理发育上的功能及作用机理至今没有搞清楚。现已了解到MMP在多细胞生物体中进化保守，而且在无脊椎动物中的MMP种类少，作用机理较为简单，便于研究。所以对无脊椎动物中MMP的研究能够为脊椎动物，乃至人类医学方面的研究提供更多的参考。目前已报道的无脊椎动物中MMP的功能类似于哺乳动物，其基本功能是参与细胞外基质成分的降解，大部分的MMP都是参与组织重构、肿瘤侵袭、先天性免疫等过程。
[0004]双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)属环节动物门多毛纲沙蚕科，作为潮间带地区的常见物种，是各种鱼类、甲壳类和海鸟的重要食饵。由于沙蚕位于水陆生态食物链的底部，能摄食底泥中的沉积物、有机碎屑和微生物等，此外，对重金属和某些工业有机污染物具有一定积累和消化作用，因此被认为是多毛类中耐污染能力较强的底栖生物。多毛类沙蚕可以很好地利用底质中的有机污染物和一些重金属转化为自身的生产力，它们作为海洋食物链中的一个分室既是生产单元，又能够净化底质，使系统内部的废弃物再利用和循环，增加环境生态效益，其体内必然存在某种解毒和防御机制，而从我们过往研究中发现双齿围沙蚕的MMP19基因能够对不同浓度外源物质的诱导呈现不同的表达特征。因此，研究沙香MMP19基因可以为基质金属蛋白酶家族功能研究开辟新的研究途径，为揭不和利用其调控机制具有重要参考价值。

【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19 (MMP19)基因序列及其克隆方法。
[0006]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:
[0007]—种双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列，双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列为SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
[0008]双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列编码蛋白，双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列编码蛋白为SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
[0009]双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列的克隆方法,首先从双齿围沙香组织中提取总RNA ;而后采用下游外侧特异性引物MMP19-0uter-R (5’ -GCAGCTTCAATGTTGTAAGG-3’ )和下游内侧特异性引物 MMP19-1nner-R (5，-GCACATCCATAGAGTCCTCA-3’ )进行 5’ -RACE 反应，克隆得到基质金属蛋白酶19基因5’端序列；再利用反向引物MMP19-F进行RT-PCR反应，克隆得到基质金属蛋白酶19基因3’端序列，反向引物MMP19-F:5’-GCCGAGGTCTGGAAGTATTG-3’ ；通过序列片段拼接矫正，最终获得基质金属蛋白酶19基因核苷酸序列SEQ IDN0.1。
[0010]本发明具有如下优点:
[0011]1.米用本发明对双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因的成功克隆 和测序,首次确定其全部编码序列和部分非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。
[0012]2.双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因的成功克隆和测序,为进一步分析MMP19影响下生物抗逆能力，为MMP19其它功能的筛选及应用奠定了基础；
[0013]3.利用本发明所得MMP19基因对不同浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例提供的双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19在不同浓度Cu胁迫下的表达效果图。
【具体实施方式】
[0015]本发明通过对双齿围沙蚕差减文库中所获得的表达序列标签(EST)与NCBI上的MMP19的EST序列进行比对分析，利用DNAstar中的SeqMan软件分析所有MMP19的同源性区域设计简并引物；其克隆方法包括:(I)通过分析近源物种基质金属蛋白酶19的EST序列及CDS序列的保守区设计简并引物MMP19-0uter-R、MMP19-1nner-R和反向引物MMP19-F ；
(2)从鲜活健康的双齿围沙蚕成体组织中提取总RNA ；(3)利用TaKaRa 5’ -Full Race试剂盒及下游外侧特异性引物MMP19-0uter-R和下游内侧特异性引物MMP19_Inner-R进行5’-RACE反应，克隆得到基质金属蛋白酶19基因5’端序列；(4)利用反向引物MMP19-F进行RT-PCR反应，克隆得到基质金属蛋白酶19基因3’端序列；另外，该反向引物还可以为序列表中SEQ ID N0.1核苷酸序列片段；(5)通过序列片段拼接矫正，最终获得基质金属蛋白酶19基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。[0016]本发明首次从双齿围沙蚕中克隆到一种基质金属蛋白酶19基因，该序列cDNA全长1310bp，其中开放阅读框位于21-1118位核苷酸，编码365个氨基酸残基。
[0017]实施例1
[0018]双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19如SEQ ID N0.1所示:
【权利要求】
1.一种双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列,其特征在于:双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列为SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
2.—种权利要求1所述的双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19基因序列编码蛋白，其特征在于:双齿围沙香基质金属蛋白酶19基因序列编码蛋白为SEQID N0.2中氣基酸序列所不。
3.—种权利要求1所述的双齿围沙蚕基质金属蛋白酶19基因序列的克隆方法，其特征在于:首先从双齿围沙蚕组织中提取总RNA;而后采用下游外侧特异性引物MMP19-0uter-R(5/ -GCAGCTTCAATGTTGTAAGG-3')和下游内侧特异性引物 MMP19_Inner-R(5; -GCACATCCATAGAGTCCTCA-3')进行5’ -RACE反应，克隆得到基质金属蛋白酶19基因5’端序列；再利用反向引物MMP19-F进行RT-PCR反应，克隆得到基质金属蛋白酶19基因3’端序列，反向引物MMP19-F:5' -GCCGAGGTCTGGAAGTATTG-3';通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白 0基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
【文档编号】C12N15/57GK103882041SQ201210563433
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】张倩茹, 魏树和, 牟文燕 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所