一种提取裂殖壶菌油脂的方法及其应用与流程

本发明涉及一种微生物油脂提取技术，特别涉及一种提取裂殖壶菌油脂的方法及其应用。

背景技术：

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，简称DHA)是重要的ω-3多不饱和脂肪酸，俗称“脑黄金”，具有促进脑细胞生长发育、保护视力、防治心血管疾病、抗癌及提高免疫能力等多种重要的生理功能。由于人体自身难以合成DHA，必须从体外摄入。深海鱼油是DHA的传统来源，但其品质易受到鱼的种类、季节和地理位置等的影响，此外，还存在DHA含量低、脂肪酸组成复杂、有鱼腥味和海洋污染物等缺点，难以满足市场需求。海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)具有生长速度快、易于培养和DHA含量高等优势，已被证实是理想的DHA生产菌株之一。

裂殖壶菌的脂质主要存在于由细胞壁所包裹的菌体细胞内。为了提取胞内油脂，需要对细胞进行破壁。不同的细胞破碎方法直接影响到油脂的产量、品质及生产成本。因此，开发低成本、高效的细胞破碎技术是实现DHA油脂大规模生产亟待解决的关键问题之一。

目前，已报道的裂殖壶菌细胞破碎方法主要有：物理法(研磨法、均质法、超声波法、冻融法和微波法)、化学法(酸法、碱法)和生物法(酶法)。其中，超声波法、冻融法和微波法仅适用于实验室处理少量样品，难以实现工业化应用；酸法中由于使用浓盐酸含有氯离子，会造成不锈钢设备的腐蚀。因此，工业上常使用研磨法、均质法、酶法或两种以上相结合的方法来破碎细胞。采用酶法时，酶与底物的空间位阻会影响酶解效果；高压均质法单次破碎效果差，在工业化生产中需要多次重复破碎，不仅易造成物料升温，而且会造成机械损耗。超高压均质技术(Ultra-High Pressure Homogenization，简称UHPH)是基于传统均质技术发展起来的一种非热加工技术，压力一般在60MPa以上，最高可达400MPa。在UHPH处理过程中，利用超高压能量使样品通过狭缝瞬间释放，在剪切效应、空穴效应、碰撞效应的作用下，使细胞破碎。因全过程在4℃-6℃的低温循环水浴中进行，可保持原有物质活性和性能，现已应用于红色诺卡氏菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、雨生红球藻、小球藻、酵母等破壁研究中。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提取裂殖壶菌油脂的方法。

本发明的另一目的在于提供所述的提取裂殖壶菌油脂的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种提取裂殖壶菌油脂的方法，包括以下步骤：

(1)将裂殖壶菌菌液在温度4℃～10℃、150MPa以上的条件下进行超高压均质破壁，得到破碎菌液；

(2)在步骤(1)得到的破碎菌液中加入碱性蛋白酶，酶解，得到酶解菌液；

(3)用萃取剂将步骤(2)得到的酶解菌液进行萃取，得到萃取液；

(4)将步骤(3)制备得到的萃取液进行旋转蒸发至恒重，得到油脂。

步骤(1)中所述的裂殖壶菌菌液的菌体浓度(湿重)优选为200g/L～300g/L；进一步优选为200g/L。

步骤(1)中所述的超高压均质破壁的压力优选为150MPa～200MPa。

步骤(1)中所述的超高压均质破壁的破壁次数优选为1次或2次，进一步优选为1次。

步骤(1)中所述的超高压均质破壁的温度优选为4℃～6℃；进一步优选为4℃。

步骤(2)中所述的碱性蛋白酶优选为液体碱性蛋白酶，酶活为24万U/mL。

步骤(2)中所述的碱性蛋白酶的酶用量优选为0.5％～6％；进一步优选为2％。

步骤(2)中所述的恒温酶解的时间优选为3h。

步骤(2)中所述的恒温酶解的反应条件优选为所用碱性蛋白酶的最适条件。

步骤(3)中所述的萃取剂优选为正己烷。

步骤(4)中所述的旋转蒸发的条件优选为操作压力为-0.095MPa、蒸发温度为40℃。

所述的油脂优选为ω-3多不饱和脂肪酸；进一步优选为二十二碳六烯酸(DHA)。

所述提取裂殖壶菌油脂的方法除了提取裂殖壶菌油脂，还可从被孢霉属、隐甲藻属或破囊壶菌目微生物中提取多不饱和脂肪酸。

所述的破囊壶菌目微生物优选为裂殖壶菌。

所述的多不饱和脂肪酸优选为ω-3多不饱和脂肪酸；进一步优选为二十二碳六烯酸(DHA)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

超高压均质技术全过程在4℃～10℃的低温循环水浴中进行，可使裂殖壶菌油脂避免在高温条件下发生变化，所得到的油脂酸价和过氧化值低，油脂质量更好；同时实现连续进样、出样，破碎效率高；酶法破壁条件温和，耗能少，工艺简单。采用两种方法相结合来破碎裂殖壶菌，不仅适合于大规模的连续作业，而且毛油提取率高于单一法。

附图说明

图1是破碎次数影响裂殖壶菌毛油提取率的统计结果图。

图2是菌体浓度影响裂殖壶菌毛油提取率的统计结果图。

图3是破碎压力影响裂殖壶菌毛油提取率的统计结果图。

图4是酶用量(0.25％、0.5％、1％)影响裂殖壶菌毛油提取率的统计结果图。

图5是酶用量(2％、4％、6％)影响裂殖壶菌毛油提取率的统计结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用的实验材料、仪器设备、裂殖壶菌发酵液制备方法及毛油提取率测定方法说明：

1.实验材料

裂殖壶菌为Schizochytrium sp.(ATCC 20888)；正己烷、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂；粉状碱性蛋白酶(最适条件：pH为9.5，温度为55℃，酶活为24万U/mL)，南宁庞博生物工程有限公司；液体碱性蛋白酶(最适条件：pH为10.5，温度为45℃，酶活为24万U/mL)，南宁东恒华道生物科技有限责任公司。

2.仪器设备

JN-02C低温超高压连续流细胞破碎仪，广州聚能纳米生物科技股份有限公司；PB-10pH计、PRACTUM1102-1CN电子天平，赛多利斯公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；CR 22GⅡ高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；RV 10旋转蒸发仪，德国IKA公司；Milli-Q Direct8纯水超纯水一体机，密理博中国有限公司。

3.裂殖壶菌发酵液制备方法

以下实施例所用的裂殖壶菌发酵液根据文献(陈丽珠.高密度培养裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸[D].福建厦门:厦门大学,2008.)中的裂殖壶菌5L发酵罐间歇发酵工艺(该文献第三章)制备得到，具体发酵条件为该文献第三章的最终优化方案，即：在25℃，搅拌转速400rpm，pH5.5，溶氧水平30％，通气量4L/min的条件下5L发酵罐培养裂殖壶菌。

4.毛油提取率测定方法

用恒重蒸发瓶收集萃取的油脂，旋转蒸发除尽溶剂后称重记为m。提油率(Y)计算公式如下：

Y＝(m/W)×100％

式中：Y-毛油提取率，％

m-毛油质量，g

W-裂殖壶菌中的油脂理论量(由酸热法测定)，g

所有数据均在相同实验条件下重复测定三次。

实施例1

(1)将裂殖壶菌发酵液经高速离心后，弃去上层液，得到菌泥，分别称取100g和125g菌泥，用去离子水重悬配制成菌体浓度为200g/L(湿重)和250g/L(湿重)的裂殖壶菌菌液各500mL，备用。

(2)步骤(1)中制得的200g/L(湿重)和250g/L(湿重)裂殖壶菌菌液分别各取3组，每组50mL，在温度4℃，压力为200MPa的条件下，进行超高压均质破壁，3组裂殖壶菌菌液分别破碎1次、2次、3次，得到破碎菌液。

(3)在步骤(2)中得到的破碎菌液中分别加入等体积量的正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层液，重复3～5次，至上层液为无色，合并上层液得正己烷萃取液。

(4)将步骤(3)中的6组正己烷萃取液分别在操作压力为-0.095MPa、蒸发温度为40℃的条件下进行旋转蒸发，回收正己烷，同时得到毛油。

结果如图1所示，两种菌体浓度下的裂殖壶菌菌液毛油提取率都随着破碎次数的增加而降低，在相同破碎次数时，菌体浓度为250g/L(湿重)的毛油提取率要低于菌体浓度为200g/L(湿重)的毛油提取率，其中，菌体浓度为250g/L(湿重)的菌液破碎3次后的毛油提取率最低仅为66.67％。本发明的研究人员发现，随着破碎次数的增加，处理时间变长，样品损失也急剧增加，会造成毛油提取率的降低。

实施例2

(1)将裂殖壶菌发酵液经高速离心后，弃去上清液，得到菌泥，分别称取100g、125g、150g、175g、200g菌泥，用去离子水重悬配制成菌体浓度为200g/L(湿重)、250g/L(湿重)、300g/L(湿重)、350g/L(湿重)、400g/L(湿重)的5组的裂殖壶菌菌液各500mL，备用。

(2)步骤(1)中制得的5组裂殖壶菌菌液分别各取50mL，在温度4℃，压力为200MPa的条件下，进行超高压均质破壁，5组裂殖壶菌菌液均破碎1次，得到破碎菌液。

(3)在步骤(2)中得到的破碎菌液中分别加入等体积量的正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层液，重复3～5次，至上层液为无色，合并上层液得正己烷萃取液。

(4)将步骤(3)中的5组正己烷萃取液分别在操作压力为-0.095MPa、蒸发温度为40℃的条件下进行旋转蒸发，回收正己烷，同时得到毛油。

结果如图2所示，毛油提取率随着菌体浓度的增加而降低，其中，菌体浓度为400g/L(湿重)的菌液破碎1次后的毛油提取率最低仅为59.8％。本发明的研究人员研究分析认为，随着菌体浓度的增加，菌液粘度变大，易造成单向阀堵塞，而且破碎过程摩擦阻力变大，破碎时温度升高，在生产上会造成毛油提取率下降，设备损耗过大。而菌体浓度过低，会导致每次收集到的碎片的量较少，使得生产效率低下，不利于工业化生产。

实施例3

(1)将裂殖壶菌发酵液经高速离心后，弃去上清液，得到菌泥，称取100g菌泥，用去离子水重悬配制成菌体浓度为200g/L(湿重)的裂殖壶菌菌液500mL，备用。

(2)取步骤(1)中制得的裂殖壶菌菌液50mL，取3组，在温度4℃，压力分别为100MPa、150MPa、200MPa的条件下，进行超高压均质破壁，3组裂殖壶菌菌液均破碎1次，得到破碎菌液。

(3)在步骤(2)中得到的破碎菌液中分别加入等体积量的正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层液，重复3～5次，至上层液为无色，合并上层液得正己烷萃取液。

(4)将步骤(3)中的3组正己烷萃取液分别在操作压力为-0.095MPa、蒸发温度为40℃的条件下进行旋转蒸发，回收正己烷，同时得到毛油。

结果如图3所示，毛油提取率随着破碎压力的增加而升高，其中在破碎压力为200MPa时，毛油提取率最高可达80％。压力是超高压均质技术的重要技术参数，其大小对裂殖壶菌细胞的破壁会产生重要影响。在一定压力范围内(150MPa～200MPa)，随着压力的升高，作用于菌体细胞的作用力增强，细胞壁被破坏的数量增加，从菌体细胞释放出的油脂越来越多，但压力过高，会造成设备成本较高。

实施例4

(1)将裂殖壶菌发酵液经高速离心后，弃去上清液，得到菌泥，称取100g菌泥，用去离子水重悬配制成菌体浓度为200g/L(湿重)的裂殖壶菌菌液500mL，备用。

(2)取步骤(1)中制得的裂殖壶菌菌液50mL，在温度10℃，压力为200MPa的条件下，进行超高压均质破壁，裂殖壶菌菌液破碎1次，得到破碎菌液。

(3)在步骤(2)中得到的破碎菌液中分别加入等体积量的正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层液，重复3～5次，至上层液为无色，合并上层液得正己烷萃取液。

(4)将步骤(3)中的萃取液分别在操作压力为-0.095MPa、蒸发温度40℃的条件下进行旋转蒸发，回收正己烷，同时得到毛油。

经测定，毛油提取率高达78.85％。

实施例5

(1)将裂殖壶菌发酵液经高速离心后，弃去上清液，得到菌泥，称取100g菌泥，用去离子水重悬配制成菌体浓度为200g/L(湿重)的裂殖壶菌菌液500mL，备用。

(2)取步骤(1)中制得的裂殖壶菌菌液50mL，在温度4℃，压力为200MPa的条件下，进行超高压均质破壁，破碎1次，得到破碎菌液。

(3)取步骤(2)中所得的破碎菌液于100mL烧杯中，分别用1mol/L的NaOH溶液调节pH至10.5，在温度为45℃的条件下分别添加0.25％、0.5％、1％、2％、4％、6％(重量百分比)的液态碱性蛋白酶或粉状碱性蛋白酶(酶活为24万U/mL)，分别置于250mL圆底烧瓶中，恒温中速搅拌酶解3h。

(4)在步骤(3)中得到的酶解后的破碎菌液中分别加入等体积量的正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层液，重复3～5次，至上层液为无色，合并上层液得正己烷萃取液。

(5)将步骤(4)中的正己烷萃取液分别在操作压力为-0.095MPa、蒸发温度为40℃的条件下进行旋转蒸发，回收正己烷，同时得到毛油。

结果如图4、图5所示，分别加入两种碱性蛋白酶后，毛油提取率都随着酶用量的增加先升高后略有降低。本发明的研究人员研究发现，当菌液经过超高压均质破碎后，酶与底物的空间位阻减弱，合适用量的酶会对细胞壁的特定组分进一步降解破壁，从而提高油脂提取率。其中，加入4％的液体碱性蛋白酶时毛油提取率最高可达93.70％。但当加入6％的液体碱性蛋白酶后，酶的添加量已过量，过量的酶会影响后续的萃取，反而降低了毛油提取率。

实施例6

(1)将裂殖壶菌发酵液经高速离心后，弃去上清液，得到菌泥，称取100g菌泥，用去离子水重悬配制成菌体浓度为200g/L(湿重)的裂殖壶菌菌液500mL，备用。

(2)取步骤(1)中制得的裂殖壶菌菌液50mL，在温度4℃，压力为200MPa的条件下，进行超高压均质破壁，破碎1次，得到破碎菌液。

(3)取步骤(2)中所得的破碎菌液于100mL烧杯中，用1mol/L的NaOH溶液调节pH至10.5，在温度为45℃的条件下添加2％(重量百分比)的液体碱性蛋白酶(酶活为24万U/mL)，置于250mL圆底烧瓶中，恒温中速搅拌酶解3h。

(4)在步骤(3)中得到的酶解后的破碎菌液中加入等体积量的正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层液，重复3～5次，至上层液为无色，合并上层液得正己烷萃取液。

(5)将步骤(4)中的正己烷萃取液在操作压力为-0.095MPa、蒸发温度为40℃的条件下进行旋转蒸发，回收正己烷，同时得到毛油。

经检测，毛油提取率高达92.12％。

对比例

1.酸热法

称取50mL的菌体浓度为200g/L(湿重)的裂殖壶菌菌液至圆底烧瓶中，按照V(浓盐酸)/V(菌液)＝4/3的比例加入浓盐酸，置于70℃恒温水浴中，搅拌反应50min后结束，冷却降温至室温。将反应液转移至分液漏斗，加入等体积正己烷充分振荡混匀，静置分层后取正己烷层移至蒸发瓶，旋蒸至恒重，称量。

酸价依据《GB/T 5009.37-2003食用植物油卫生标准的分析方法》中的方法进行测定。

过氧化值依据《GB/T 5009.37-2003食用植物油卫生标准的分析方法》中的第一法滴定法进行测定。

表1不同提取方法得到的毛油对比

结果如表1所示，采用本发明的提取方法，毛油提取率高达92.12％；同时，通过本发明的提取方法所获得的毛油品质(酸价和过氧化值)都优于酸热法。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。