一种家蚕中肠蛋白亚细胞组份的分离方法与流程

本发明属于昆虫分子生物学领域，具体涉及提取分离家蚕中肠亚细胞组份，将家蚕中肠总蛋白分成三个组份，分别为线粒体、微粒体和胞浆酶源。

背景技术：

蛋白质组学研究已经成为后基因组时代生物学基础研究的基本技术手段，家蚕蛋白质组学研究也是当前的研究热点。当前，家蚕中肠总蛋白的提取主要是利用含有8mpl/L尿素或硫脲的蛋白提取液进行提取，分离提取的蛋白可用于双向电泳的分离，质谱鉴定。家蚕中肠总蛋白中含有线粒体、微粒体和胞浆酶源等不同亚组份蛋白，且具有不同的功能，该方法提取的是家蚕中肠总蛋白，用于双向电泳后蛋白组份过多，不能有效分离鉴定。目前的蛋白质组学分析所用蛋白均是此种方法获得的总蛋白，不能有效比较不同类型的亚组份蛋白具有不同的功能。

如果通过对家蚕中肠总蛋白进行不同亚细胞组份的分离，分别对线粒体、微粒体和胞浆酶源等亚细胞组份进行研究可以从较大程度上提高结果的分辨率，增加结果的可信度。到目前为止，关于家蚕中肠亚细胞组份比较详细的提取方法，以及基于亚细胞水平的蛋白质组学相关研究尚未见有报道。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是降低家蚕中肠总蛋白的复杂性以及提高蛋白水平分析的分辨率。

本发明采用的技术方案如下：

一种家蚕中肠蛋白亚细胞组份的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：

A、首先将家蚕中肠组织液氮研磨成粉，加入适量的提取液，先超声振荡20-30s，在冰上放置2-3min，然后重复上述过程2-3次混匀，于冰上匀浆静置28-32min，然后经1000rpm离心5-6min，去除沉淀后，得到悬浮液为家蚕中肠总蛋白；

B、将步骤(A)获得的悬浮液在4℃下，转速1000rpm，离心9-10min后，得到的沉淀，即为线粒体蛋白，离心所得的上清液，备用；

C、向步骤(B)离心获得的上清中加入等体积的16mM CaCl2溶液，混匀后置于0-4℃的环境下静置5-6min，然后在4℃下，12000rpm，离心9-10min后，得到的沉淀为微粒体蛋白；

D、步骤(C)获得的上清与预冷丙酮按照1:3.5-4.5的体积进行混合，混匀后在-18℃～-22℃的环境下放置过夜，再经4℃，12000rpm，离心10min后去上清，沉淀即为胞浆酶源蛋白。

所述的家蚕中肠蛋白亚细胞组份的分离方法，其特征在于：中肠组织用液氮研磨成粉末后再加入到一定体积的提取液，中肠组织与提取液的质量体积比μg/ml为100:1。

所述的家蚕中肠蛋白亚细胞组份的分离方法，其特征在于：步骤(D)中所述的含有胞质酶源的上清与丙酮的混合体积比为1:4，放置过夜的温度为-20℃。

所述的家蚕中肠蛋白亚细胞组份的分离方法，其特征在于,所述的提取液为：其由0.1M KH₂PO₄溶液和1.0mM蛋白酶抑制剂PMSF溶液混合而得。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

本发明采用以离心和高浓度盐使蛋白沉淀的方法，使不同亚组份的蛋白质得以分离，采用本发明的方法分离家蚕中肠总蛋白，得到较好的分离效果。经SDS-PAGE，2-DE以及质谱分析验证，可以证明家蚕中肠亚细胞组份离效果较高，且没有出现污染情况。因此，经过分离后的家蚕中肠亚细胞组份蛋白，可用于其他蛋白水平分析，以提高实验分辨率，增加结果可信度。

发明人对分离提取的后家蚕中肠亚细胞蛋白分别采用一维SDS-PAGE以及二维双向电泳(2-DE)结合质谱(MS)分析进行进一步的验证，分析发现家蚕中肠的三个亚组份得到了较好的分离，并没有出现污染。

显然根据发明的上述内容，可以高效的分离出家蚕中肠的三种亚细胞组份。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析家蚕中肠三个亚细胞组份分离情况(1，Marker；2，总蛋白；3，线粒体；4，微粒体；5，胞质酶源)的扫描图；

图2为2-DE分析家蚕中肠三个亚细胞组份提取分离情况的的扫描图。

具体实施方式

1实验材料

1.1试剂

生化试剂SDS、丙烯酰胺、Tris、过硫酸铵、TEMED、溴酚蓝、甘油、甘氨酸、甲叉丙烯酰胺、Bradford reagent、考马斯亮蓝R-250和G-250、尿素、硫脲、CHAPS、TrionX-100、DTT、PMSF、碘乙酰胺、低熔点琼脂糖、硫酸铝、85％正磷酸、无水乙醇等化学试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Bio-lyte pI 3-10和17cm pH 5-8预制胶条，购自Bio-Rad(USA)；2-DE clean up kit购自GE Healthcare(USA)。

1.2家蚕

家蚕品系P50由安徽农业大学生命科学学院蚕学系提供。

1.3方法

1.3.1家蚕中肠亚细胞组份提取分离

首相将家蚕中肠液氮研磨粉碎，先超声振荡25s，在冰上放置2min，然后重复上述过程2次混匀，于冰上匀浆静置30min，然后经1000rpm离心5min，去除沉淀后，得到悬浮液为家蚕中肠总蛋白，去除沉淀后，得到悬浮液为家蚕中肠总蛋白，将总蛋白悬浮液在4℃中,12000rpm,离心10min后，得到的沉淀即为线粒体蛋白，并用0.1M KH2PO4溶液洗涤三次，加入200μL水化液(水化液的成分为7M尿素、2M硫脲、60mM DTT、65mM CHAPS、2％Triton X-100和0.2％两性电解质等电点pI＝5-8混合而得的混合液)进行溶解。向上清中加入等体积的16mM CaCl2溶液，颠倒混匀并于冰上静置5min，在4℃中12000rpm离心10min后，得到的沉淀即为微粒体蛋白，并用0.1M KH₂PO₄溶液洗涤三次，最后将沉淀于200μL水化液中溶解。将上清与预冷丙酮按照1:4体积进行混合，混匀后于-20℃放置过夜，经4℃，12000rpm，离心10min后去上清，沉淀即为胞浆酶源蛋白，于室温放置6min后加入水化液溶解；为了去除其中的盐离子，根据Clean up kit(GE Healthcare,USA)说明书对胞浆酶源蛋白进行纯化，最后将纯化后的胞浆酶源蛋白沉淀于200μL水化液中溶解。

1.3.2蛋白定量

家蚕中肠总蛋白以及三亚组份蛋白浓度采用Bradford方法进行定量分析。

1.3.3 SDS-PAGE分析

总蛋白以及三个亚组份按照相同上样量进行上样，电泳结束后，采用考马斯亮蓝R-250染色液染色，凝胶脱色后对蛋白胶进行扫描分析。结果见图1。

1.3.4 2-DE分析

将330μL 800μg蛋白样品加入到聚焦盘中，设定好程序后进行等点聚焦；聚焦结束后，将胶条转到SDS-PAGE胶上进行电泳；电泳结束后，采用考马斯亮蓝G-250染色液染色，凝胶脱色后对蛋白胶进行扫描分析。结果见图2。

1.3.5质谱分析

从三个亚组份中分别挖取10个蛋白点进行MALDI-TOF MS质谱分析。结果见表1，2，3。

图1为SDS-PAGE分析家蚕中肠三个亚细胞组份分离情况(1，Marker；2，总蛋白；3，线粒体；4，微粒体；5，胞质酶源)

图1结果表明，三亚细胞组份间的蛋白条带明显不同，比如线粒体蛋白在30kDa左右出现了信号较强的蛋白条带，而在另外两个组份中并有出现；微粒体蛋白在29kDa左右有明显的条带，而在另外两个组份中并没有出现；胞浆酶源蛋白中，35kDa左右出现明显的蛋白条带，但在另外两组份中没有出现；但三个亚组份中的蛋白条带在总蛋白中均有条带与之对应。

图2为2-DE分析家蚕中肠三个亚细胞组份提取分离情况，结果表明，三个亚细胞组份的蛋白点的数量和分布完全不同。线粒体的数量比微粒体的要多，但是远比胞质酶源的少。线粒体的蛋白不仅在高分子量的位置有分布，在低分子量的位置也有分布；微粒体蛋白基本分布于高分子量位置；胞质酶源蛋白主要分布于高分子量位置，低分子量位置有分布，但比例较低。

家蚕中肠三个亚组份部分蛋白点的质谱结果

表1.线粒体蛋白点质谱结果

表2.微粒体蛋白点质谱结果

表3.胞浆酶源蛋白点质谱结果

根据质谱结果，对各个亚组份蛋白点的质谱注释结果进行分析统计，并没有出现亚细胞组份间的污染情况。

1.3.4结论

通过发明人提供的家蚕中肠亚细胞组份提取分离的方法，家蚕中肠总蛋白得到较好的分离。经SDS-PAGE，2-DE以及质谱分析验证，可以证明家蚕中肠亚细胞组份离效果较高，且没有出现污染情况。因此，经过分离后的家蚕中肠亚细胞组份蛋白，可用于其他蛋白水平分析，以提高实验分辨率，增加结果可信度。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。