本发明属于植物有效成分提取领域，具体涉及一种银杏内酯的提取方法。
背景技术：
银杏内酯（ginkgolide）是银杏叶中一类重要的活性成分，属于二萜内酯化合物。银杏内酯分子具有独特的十二碳骨架结构，嵌有一个叔丁基和六个五元环，包括一个螺壬烷、一个四氢呋喃环和三个内酯环。其中，包括银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内脂M、银杏内脂J、银杏内脂K和银杏内脂L，差别在于含有的羟基数目和羟基连接的位置不同。
血小板活化因子（PAF）是血小板和多种炎症组织分泌产生的一种内源性磷脂，是迄今发现的最有效的血小板聚集诱导剂，它与许多疾病的产生、发展密切相关。而银杏内酯对PAF受体有着强大的特异性抑制作用，目前被认为是最有临床应用前景的天然PAF受体拮抗剂。
目前，获得银杏内酯的途径有4种：化学合成、生物合成、细胞培养和天然提取，前3种途径目前仍仅限于实验室研究，未进入工业化生产，天然银杏叶仍是提取银杏内酯的主要来源，而银杏内酯在银杏叶中的含量很低，导致银杏内酯的药用资源受到限制，因此，如何提高其提取含量和效率成为当前亟待解决的问题。
技术实现要素：
针对以上问题，本发明提出一种银杏内酯的提取方法，该方法操作简单，成本低廉，不需大型仪器设备，且提取效率较高，能更加充分提取银杏叶中的银杏内酯，并提高粗品纯度。
为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量10～20倍的体积浓度为60～70%的酒精，控制温度为50～60℃，进行浸提30～60min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重10～15倍的体积浓度为40～50%的酒精，控制温度为50～60℃，进行浸提30～60min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行超声波处理20～40min，然后静置10～20min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2～3倍；所述超声波优选30～40KHz；
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理20～30min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的4～6倍，所述超声波优选50～60Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量不低于60wt%），再溶于体积浓度为50～60%的酒精中，结晶，即得高纯度的银杏内酯混合物。
所述改性凹凸棒石由以下步骤制成：
将凹凸棒石浸没于浓度为6～10wt%的NaCl水溶液中，搅拌混合30min，再静置40min后过滤，将所得滤渣反复洗涤（清水洗涤），至用AgNO3检测洗涤液无氯离子为止，得到钠化凹凸棒石；
将所得钠化凹凸棒石浸没于浓度为8～12wt%的Gemini季铵盐水溶液中，在70℃条件下用20～30Hz超声处理6～8h，再静置40min后过滤，经真空干燥，得到改性凹凸棒石。
所述Gemini季铵盐水溶液优选酯基季铵盐水溶液，更优选市售的酯基季铵盐31441-1。
本发明具有以下积极有益效果：
本发明提取方法操作简单，成本低廉，不需大型仪器设备，且提取效率较高，能更加充分提取银杏叶中的银杏内酯，并提高粗品纯度。
（1）本发明提取方法操作简单，不需要气液相过柱等繁琐操作，同时也省去了这些大型仪器设备的投入，可节约大量生产经费。
（2）本发明所用凹凸棒石原材料易得、价廉，且可循环使用，可有效减少废料的产生。
（3）由于凹凸棒石孔径分布非常均一，使其呈现筛分功能，而银杏内酯化合物的分子体型较匹配，能较稳定地存留于其晶穴内部，形成稳定吸附。本发明提取方法先利用较低频超声波的空化作用将目标化合物吸附于晶穴内，后再采用更高能量的超声波进行交换洗脱，具有很强的针对性。
（4）本发明所用凹凸棒石作为一种分子筛，其对物质的吸附来源于物理吸附（范德华力），其晶体孔穴内部有很强库仑场，对极性分子表现出强烈的吸附能力，故它与极性较弱的银杏内酯的亲和性较差，经本发明改性（有机化）后可显著提高其对银杏内酯的吸附性能。而改性过程中Gemini季铵盐不溶于乙酸乙酯，方便进行洗脱分离。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量10倍的体积浓度为60%的酒精，控制温度为50℃，进行浸提30min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重10倍的体积浓度为40%的酒精，控制温度为50℃，进行浸提30min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行超声波处理20min，然后静置10min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2倍；所述超声波频率为30KHz；
所述改性凹凸棒石由以下步骤制成：
将凹凸棒石浸没于浓度为8wt%的NaCl水溶液中，搅拌混合30min，再静置40min后过滤，将所得滤渣反复洗涤（清水洗涤），至用AgNO3检测洗涤液无氯离子为止，得到钠化凹凸棒石；
将所得钠化凹凸棒石浸没于浓度为10wt%的Gemini季铵盐水溶液（酯基季铵盐31441-1）中，在70℃条件下用20Hz超声处理6h，再静置40min后过滤，经真空干燥，得到改性凹凸棒石。
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理20min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的4倍，所述超声波频率为50Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量60wt%），再溶于体积浓度为50%的酒精中，结晶，即得银杏内酯混合物，经检测，具体参数见表1。
实施例2
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量20倍的体积浓度为70%的酒精，控制温度为60℃，进行浸提60min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重15倍的体积浓度为50%的酒精，控制温度为60℃，进行浸提60min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行超声波处理40min，然后静置20min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的3倍；所述超声波频率为40KHz；
所述改性凹凸棒石由以下步骤制成：
将凹凸棒石浸没于浓度为8wt%的NaCl水溶液中，搅拌混合30min，再静置40min后过滤，将所得滤渣反复洗涤（清水洗涤），至用AgNO3检测洗涤液无氯离子为止，得到钠化凹凸棒石；
将所得钠化凹凸棒石浸没于浓度为10wt%的Gemini季铵盐水溶液（酯基季铵盐31441-1）中，在70℃条件下用20Hz超声处理6h，再静置40min后过滤，经真空干燥，得到改性凹凸棒石。
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理30min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的6倍，所述超声波频率为60Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量68wt%），再溶于体积浓度为60%的酒精中，结晶，即得银杏内酯混合物，经检测，具体参数见表1。
实施例3
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量15倍的体积浓度为65%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提35min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重12倍的体积浓度为45%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提45min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行超声波处理30min，然后静置15min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2.5倍；所述超声波频率为35KHz；
所述改性凹凸棒石由以下步骤制成：
将凹凸棒石浸没于浓度为8wt%的NaCl水溶液中，搅拌混合30min，再静置40min后过滤，将所得滤渣反复洗涤（清水洗涤），至用AgNO3检测洗涤液无氯离子为止，得到钠化凹凸棒石；
将所得钠化凹凸棒石浸没于浓度为10wt%的Gemini季铵盐水溶液（酯基季铵盐31441-1）中，在70℃条件下用20Hz超声处理6h，再静置40min后过滤，经真空干燥，得到改性凹凸棒石。
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理25min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的5倍，所述超声波频率为55Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量65wt%），再溶于体积浓度为55%的酒精中，结晶，即得银杏内酯混合物，经检测，具体参数见表1。
实施例4
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量15倍的体积浓度为65%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提35min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重12倍的体积浓度为45%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提45min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行超声波处理30min，然后静置15min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2.5倍；所述超声波频率为35KHz；所述改性凹凸棒石参考专利文献CN201410453968.X实施例1制成；
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理25min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的5倍，所述超声波频率为55Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量不低于60wt%），再溶于体积浓度为55%的酒精中，结晶，即得银杏内酯混合物，经检测，具体参数见表1。
实施例5
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量15倍的体积浓度为65%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提35min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重12倍的体积浓度为45%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提45min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行超声波处理30min，然后静置15min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2.5倍；所述超声波频率为55KHz；
所述改性凹凸棒石由以下步骤制成：
将凹凸棒石浸没于浓度为8wt%的NaCl水溶液中，搅拌混合30min，再静置40min后过滤，将所得滤渣反复洗涤（清水洗涤），至用AgNO3检测洗涤液无氯离子为止，得到钠化凹凸棒石；
将所得钠化凹凸棒石浸没于浓度为10wt%的Gemini季铵盐水溶液（酯基季铵盐31441-1）中，在70℃条件下用20Hz超声处理6h，再静置40min后过滤，经真空干燥，得到改性凹凸棒石。
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理25min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的5倍，所述超声波频率为35Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量65wt%），再溶于体积浓度为55%的酒精中，结晶，即得银杏内酯混合物，经检测，具体参数见表1。
实施例6
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量15倍的体积浓度为65%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提35min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重12倍的体积浓度为45%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提45min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行超声波处理30min，然后静置15min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2.5倍；所述超声波频率为25KHz；
所述改性凹凸棒石由以下步骤制成：
将凹凸棒石浸没于浓度为8wt%的NaCl水溶液中，搅拌混合30min，再静置40min后过滤，将所得滤渣反复洗涤（清水洗涤），至用AgNO3检测洗涤液无氯离子为止，得到钠化凹凸棒石；
将所得钠化凹凸棒石浸没于浓度为10wt%的Gemini季铵盐水溶液（酯基季铵盐31441-1）中，在70℃条件下用20Hz超声处理6h，再静置40min后过滤，经真空干燥，得到改性凹凸棒石。
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理25min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的5倍，所述超声波频率为65Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量65wt%），再溶于体积浓度为55%的酒精中，结晶，即得银杏内酯混合物，经检测，具体参数见表1。
对比例1
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量15倍的体积浓度为65%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提35min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重12倍的体积浓度为45%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提45min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量市售凹凸棒石（未进行改性），进行超声波处理30min，然后静置15min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2.5倍；所述超声波优选35KHz；
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行超声波处理25min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的5倍，所述超声波优选55Hz；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量不低于60wt%），再溶于体积浓度为55%的酒精中，结晶，即得，经检测，具体参数见表1。
对比例2
一种银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：
（1）取一定量银杏叶进行粉碎，以干重计，加入其重量15倍的体积浓度为65%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提35min，然后过滤；
（2）再在步骤（1）所得滤渣中加入所述银杏叶干重12倍的体积浓度为45%的酒精，控制温度为55℃，进行浸提45min，然后过滤；
（3）合并两次浸提液，加入一定量改性凹凸棒石，进行搅拌混匀处理60min，然后静置15min，过滤；所述改性凹凸棒石用量为所述银杏叶干重的2.5倍；
所述改性凹凸棒石由以下步骤制成：
将凹凸棒石浸没于浓度为8wt%的NaCl水溶液中，搅拌混合30min，再静置40min后过滤，将所得滤渣反复洗涤（清水洗涤），至用AgNO3检测洗涤液无氯离子为止，得到钠化凹凸棒石；
将所得钠化凹凸棒石浸没于浓度为10wt%的Gemini季铵盐水溶液（酯基季铵盐31441-1）中，在70℃条件下用20Hz超声处理6h，再静置40min后过滤，经真空干燥，得到改性凹凸棒石。
（4）将步骤（3）所得滤渣加入一定量乙酸乙酯中，进行搅拌混匀处理50min，过滤后，收集滤液，静置；所述乙酸乙酯用量为所述银杏叶干重的5倍；
（5）将步骤（4）所得滤液浓缩后（固含量65wt%），再溶于体积浓度为55%的酒精中，结晶，即得，经检测，具体参数见表1。
产品成分检测：
采用液相色谱仪对以上所得产品进行成分检测，得到色谱图后，用外标两点法对数方程计算各银杏内酯化合物的含量，并转化为单位重量银杏叶内的提取率，结果见表1。
表1 所得产品各银杏内酯的提取率及总内酯纯度对比
上面结合实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。