银杏叶提取物及其制剂的制作方法

专利名称：银杏叶提取物及其制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及银杏叶的提取物及其制剂。具体讲是银杏内酯提取物与银杏黄酮提取物的组合物及其药物制剂。本发明还涉及银杏叶提取物及其制剂的制备方法。
背景技术：
银杏药用至今已有600多年的历史，对其进行药理及其他应用研究始于70年代，近十年来发展很快，目前，集中在银杏叶中提取的银杏内酯和银杏黄酮的开发和利用上。根据以往报道，银杏内酯和银杏黄酮类物质对于治疗心血管疾病和脑血管疾病有较好的治疗效果。关于银杏内酯和银杏黄酮的提取方法已经有很多报道，例如CN1281856A公开了微波提取银杏黄酮和银杏内酯类物质的方法。银杏内酯是从中草药银杏叶当中提取获得的有效物质，该物质从结构上还可以进一步细分为银杏内酯A、B、C、K(银杏内酯K是发明人新发现的一个银杏内酯单体，已另案申请，申请号是02128965.4)等，对于银杏内酯提取方法的报道，还可以参见以下文献李新岗等人介绍了银杏内酯的实验室提取方法(参见李新岗等，银杏叶中银杏内酯的实验室提取方法研究，中国医药工业杂志1998年第1期)，中国专利文献CN1195665A介绍了银杏内酯的提取方法和含有银杏内酯的制剂，该方法是将银杏叶用水煮沸提取，用吸附剂对提取滤液吸附，再用乙醇脱附，回收乙醇，将析出的结晶溶解，重结晶，干燥制得银杏内酯。中国专利文献CN1313287A公开了一种银杏内酯的生产工艺。从银杏内酯的总提取物当中分离银杏内酯单体的方法，也有很多相关的文献报道，例如，游松等人介绍了银杏叶中银杏内酯的分离与结构测定方法(参见游松等，银杏叶中银杏内酯的分离与结构测定，中国药物化学杂志1995年第4期)。中国专利文献CN1287121A公开了由银杏叶或银杏叶浸膏制备药物银杏内酯A、B的方法。银杏内酯作为一个有效的活性物质，可以将其制备成不同的临床药物剂型。用银杏内酯制备注射剂的方法已经在中国专利文献CN1315175A当中公开。刘洁等使用银杏叶注射剂治疗急性脑梗塞取得了一定疗效[参见刘洁等，银杏叶注射液对急性脑梗塞后肢体运动功能及TXB_2、6-Keto-PGF_(1a)的影响]。关于银杏内酯的药理作用，已经有较为详细的文献报道(参见陈维军等，银杏内酯的化学结构及药理作用研究进展，中国药学杂志1998年第9期)。尽管现有技术当中对于银杏内酯及其制剂的研究已经有很多的报道，但是，对于银杏内酯的研究一直没有停止，特别是对于银杏内酯单体的分离及其衍生物的研究，不断有文献报道。本发明人在发现了银杏内酯K的结构基础上，通过对银杏内酯进一步精制和控制质量，特别是对银杏黄酮进一步进行了精制，并通过实验研究，找到了银杏内酯与银杏黄酮的特定配比进行组合，将其制备成药剂，完成了本发明。

发明内容
本发明目的是提供一种药物组合物以及由该组合物制备的药物制剂。
本发明还提供了药物组合物及其制剂的制备方法。
本发明药物组合物为银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物的组合物，其中银杏内酯和银杏黄酮提取物可以通过对市售或自制的银杏内酯和银杏黄酮粗品进行精制而获得，银杏内酯和银杏黄酮粗品可以按照常规的已知方法制备。
银杏内酯的精制方法及其鉴别和含量测定方法如下1、银杏内酯精制方法取银杏内酯粗品，加8倍量乙醇，50～60℃水浴，搅拌溶解，过滤，滤液浓缩至总量的八分之一至四分之一，静置，冷却，析晶，过滤，重复上述操作，直至经检验本品中银杏内酯各成分符合要求，取晶体减压低温干燥，即得2、含量测定方法照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以异丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)为流动相，检测波长220nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000，各相邻峰之间的分离度及拖尾因子应符合要求。
银杏内酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验还可以是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-水-四氢呋喃＝70∶25∶10；蒸发光散射检测器，检测参数漂移管温度105摄氏度，载气为氮气，载气流速3.10升/min；理论踏板数按银杏内酯A峰计，应不低于3500。
对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的银杏内酯A、B、K、白果内酯适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的本品20mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，测定，即得。
结果银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于90.0％，银杏内酯原料中各成分的含量要求如下银杏内酯A30％～40％银杏内酯B50％～60％银杏内酯k≥0.5％白果内酯≥0.5％3、银杏内酯的鉴别方法(1)高效液相色谱法按照上述含量测定方法当中的高效液相色谱条件试验，供试品中银杏内酯B的保留时间应与对照品一致。
(2)薄层色谱法取银杏内酯1mg加50％丙酮1ml溶解，另取银杏内酯A、B、C、K和白果内酯对照品各1mg分别加50％丙酮1ml溶解，照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)，用微量点样器分别取上述供试品和对照品溶液各10μL点样于同一块含4％醋酸钠的0.5％CMC-Na溶液制成的硅胶GF254薄板上，以石油醚-丙酮-甲醇(10∶2.5∶0.3)为展开剂，上行展开后，取出，吹干，于160℃加热30分钟，置紫外灯365nm下检视，供试品与对照品应在对应位置上显示相同颜色的斑点。
4、银杏酸检查照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)检查，供试品溶液峰面积不得大于对照品溶液峰面积。
色谱条件与系统适应性实验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸(83∶17∶0.5)为流动相；检测波长243nm。理论塔板数按银杏酸计应不低于7000，银杏酸与其它成分的分离度应符合要求。
对照品溶液的制备精密称取银杏酸对照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，精密量取该溶液5.0ml，定量转移至100mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，混匀，作为对照溶液，浓度为25μg/ml。
供试品溶液的制备精密称取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小时，回收溶媒，残渣以甲醇溶解并定容至1mL，该溶液经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL分别注入液相色谱仪，测定，即得。银杏酸含量不得高于0.0005％，最好不得高于0.0002％。
银杏黄酮的精制及含量测定方法和鉴别方法如下1、银杏黄酮的精制方法取银杏黄酮提取物，加95％乙醇在60摄氏度水浴中溶解，先通过沙芯漏斗过滤，再经过10000分子量以下超滤膜超滤，收集滤液，60摄氏度减压浓缩，40～50摄氏度真空干燥，即得。
2、银杏黄酮的含量测定方法用高效液相色谱法测定。
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)为流动相；检测波长为370nm；理论塔板数以斛皮素峰计算，应不低于6000。
对照品溶液的制备精密称取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg异鼠李素对照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液。精密吸取适量储备液用甲醇或流动相稀释配成浓度分别为斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，异鼠李素1μg/ml，的对照品溶液。
供试品溶液的制备精密称取银杏黄酮提取物50mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml于锥形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％盐酸缓慢加热至回流，回流1小时，冷却。溶液转移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
本提取物中含黄酮甙的总量不低于25％。其中各黄酮甙的含量范围是斛皮素12～18％，山柰酚7～13％，异鼠李素1～4％。
本发明银杏黄酮提取物的鉴别方法取银杏黄酮提取物溶于5ml甲醇，取1滴滴于滤纸上吹干后喷洒10％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置365nm紫外灯下观察，呈黄色荧光。
银杏酸含量检查照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)检查。
色谱条件与系统适应性实验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸(83∶17∶0.5)为流动相；检测波长243nm。理论塔板数按银杏酸计应不低于7000，银杏酸与其它成分的分离度应符合要求。
对照品溶液的制备精密称取银杏酸对照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，精密量取该溶液5.0ml，定量转移至100mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，混匀，作为对照溶液，浓度为25μg/ml。
供试品溶液的制备精密称取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小时，回收溶媒，残渣以甲醇溶解并定容至1mL，该溶液经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL分别注入液相色谱仪，测定，即得。总银杏酸含量不得高于0.0005％。
本发明药物提取物由银杏内酯提取物与银杏黄酮提取物组成，二者的比例是(19-4)∶(1-3)。
本发明所述银杏内酯提取物与银杏黄酮提取物的优选比例是(15-5)∶(1-2)，更优选的比例是(10-8)∶(1-2)，其中进一步的优选比例为银杏内酯提取物∶银杏黄酮提取物＝19∶1，本发明将这种原料组合物称为组合物G1；银杏内酯提取物∶银杏黄酮提取物＝8∶1，本发明将这种原料组合物称为组合物G2；银杏内酯提取物∶银杏黄酮提取物＝5∶2，本发明将这种原料组合物称为组合物G3；银杏内酯提取物∶银杏黄酮提取物＝4∶3，本发明将这种原料组合物称为组合物G4；其中银杏内酯提取物与银杏黄酮提取物的特别优选比例为8∶1。
上述不同比例的药物组合物充分混匀，作为本发明药物制剂的活性成分原料，按照常规工艺，可以制备成不同的临床药物剂型，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、口服液体制剂、注射剂等。
本发明药物口服制剂的制备工艺如下分别取上述几种混合物100g，加入淀粉、糊精50～200g，充分混匀，用乙醇制粒，干燥。制成硬胶囊、片剂；或取PEG400276.0g置适宜容器内，加入PEG60006.0g，水浴加热至PEG6000溶解，搅匀，加入甘油18.0g，加入银杏提取物100.0g，用胶体磨研磨成均匀的膏体，转移至软胶囊机的贮料桶，用约0.3ml的模具压制成软胶囊或制成其他口服制剂等，硬胶囊、软胶囊或片剂每粒或每片含银杏提取物0.1g，服用方法是每次1～2粒或片，每日三次。
为了保证所制备药物制剂的稳定性，本发明还研制了上述不同比例组合物口服制剂的质量控制标准和含量测定方法及鉴别方法。
上述制剂的含量测定方法如下1.银杏内酯的含量测定照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以异丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)为流动相，检测波长220nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000，各相邻峰之间的分离度及拖尾因子应符合要求。
银杏内酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验还可以是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-水-四氢呋喃＝70∶25∶10；蒸发光散射检测器，检测参数漂移管温度105摄氏度，载气为氮气，载气流速3.10升/min；理论踏板数按银杏内酯A峰计，应不低于3500。
对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的银杏内酯A、B、K、白果内酯适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密称取本品100mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，测定，即得。
按照上述方法测定本发明所述药物组合物当中银杏内酯的含量，应当符合下述要求组合物G1制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于85.0％；组合物G2制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于80.0％；组合物G3制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于64.0％；组合物G4制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于51.0％。
2、银杏黄酮的含量测定用高效液相色谱法测定色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)为流动相；检测波长为370nm；理论塔板数以斛皮素峰计算，应不低于6000。
对照品溶液的制备精密称取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg异鼠李素对照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液。精密吸取适量储备液用甲醇或流动相稀释配成浓度分别为斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，异鼠李素1μg/ml，的对照品溶液。
供试品溶液的制备精密称取本品100mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，过滤，精密吸取5ml于锥形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％盐酸缓慢加热至回流，回流1小时，冷却。溶液转移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
按照上述方法测定本发明所述药物组合物口服制剂当中银杏黄酮的含量，应当符合下述要求组合物G1中含黄酮甙的总量不低于1.25％；组合物G2中含黄酮甙的总量不低于2.8％；组合物G3中含黄酮甙的总量不低于7.0％；组合物G4中含黄酮甙的总量不低于10.5％本发明所述药物组合物口服制剂的鉴别方法如下1.取本发明所述药物组合物或其制剂1g，溶于10ml甲醇，取1滴滴于滤纸上吹干后喷洒10％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置365nm紫外灯下观察，呈黄色荧光。
2.薄层色谱法取本发明所述药物组合物或其制剂适量，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取银杏内酯A、B、C、K和白果内酯对照品各1mg分别加甲醇1ml溶解，照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)，用微量点样器分别取上述供试品和对照品溶液各10μL点样于同一块含4％醋酸钠的0.5％CMC-Na溶液制成的硅胶GF254薄板上，以石油醚-丙酮-甲醇(10∶2.5∶0.3)为展开剂，上行展开后，取出，吹干，于160℃加热30分钟，置紫外灯365nm下检视，供试品与对照品应在对应位置上显示相同颜色的斑点。
本发明所述药物组合物口服制剂当中所含银杏酸的检查方法照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)检查，供试品溶液峰面积不得大于对照品溶液峰面积。
色谱条件与系统适应性实验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-冰醋酸(83∶17∶0.5)为流动相；检测波长243nm。理论塔板数按银杏酸计应不低于7000，银杏酸与其它成分的分离度应符合要求。
对照品溶液的制备精密称取银杏酸对照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，精密量取该溶液5.0ml，定量转移至100mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，混匀，作为对照溶液，浓度为25μg/ml.
供试品溶液的制备精密称取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小时，回收溶媒，残渣以甲醇溶解并定容至1mL，该溶液经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。
测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL分别注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明所述药物组合物口服制剂当中所含银杏酸含量不得高于0.0004％。
本发明药物组合物注射剂的制备工艺是制备工艺1取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高压灭菌30min，取出后于10000级配料室加热至80℃，加入研细过80目筛的本发明药物组合物5.0～6.0g，加热至溶解，冷却至室温后用10％的柠檬酸水溶液调pH至8.0，溶解后加注射用NaCl 8.0g，加注射用水调至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，熔封，质检，印字，包装。或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化钠等其中之一作为支架剂，支架剂的量相当于药物组合的1～4倍，分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂，质检，印字，包装。
制备工艺2取本发明所述药物组合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml、pH6.8的磷酸盐缓冲溶液350ml，充分混匀，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22 m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，熔封，质检，印字，包装。或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化钠等其中之一作为支架剂，支架剂的量相当于药物组合的1～4倍，溶解后一起分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；制备工艺3取本发明所述药物组合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，熔封，质检，印字，包装。或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化钠等其中之一作为支架剂，支架剂的量相当于药物组合的1～4倍，溶解后一起分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；制备工艺4取本发明所述组合物，加入2％～10％乙醇溶液溶解，加2％~10％乙醇溶液调至总量，微孔滤膜过滤，分装，即得。优选方案是取本发明所述组合物5.0～6.0g，加入用注射用水配制的3.5％乙醇溶液溶解，加3.5％乙醇溶液调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装10ml安瓿，即得。
上述四种制备工艺经稳定性考察，均符合制剂要求。该注射剂的含量测定方法及鉴别方法如下1、薄层鉴别供试品的制备取本发明所述药物组合物粉针剂，加蒸馏水溶解，取1ml或直接取注射液1ml以6mol/L盐酸溶液0.2ml酸化，待结晶析出，放置30分钟，离心(3000转/分钟)10分钟，弃去上清液，沉淀以少量水洗至中性后加1ml丙酮溶解即得。
对照品溶液的制备取银杏内酯A、B、C、K对照品适量，加丙酮溶解，制成每1mL分别含1mg、1mg、1mg、0.01mg，即得。
测定法照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录VI B)，用微量点样器分别取上述供试品和对照品溶液各10μL点样于同一块含4％醋酸钠，用0.5％CMC-Na溶液制成的硅胶GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-丙酮-甲醇(10∶2.5∶0.3)为展开剂，上行展开，取出，吹干，于160℃加热30分钟，置紫外灯365nm下检视，供试品与对照品应在对应位置上显示相同颜色的斑点。
2、取本发明所述药物组合物制备的溶液1滴滴于滤纸上吹干后喷洒10％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置365nm紫外灯下观察，呈黄色荧光。
本发明注射剂当中银杏内酯和银杏黄酮的含量测定方法如下1、银杏内酯含量测定色谱条件与系统适应性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以异丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)为流动相；检测波长220nm。理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000，各峰之间的分离度应符合药典要求。
对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的银杏内酯A、B、K对照品适量，分别以50％丙酮溶解，制成每1mL含0.5mg、0.5mg、0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品5ml置10ml量瓶中，加入6mol/L的盐酸溶液1ml，室温放置3.5小时，以丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，经微孔滤膜(孔径0.45μm)滤过，即得。该供试溶液应在2小时内测定。
测定法精密量取供试品溶液及对照溶液各20μL分别注入液相色谱仪，测定，即得。
银杏内酯的含量测定还可以按下法进行测定银杏内酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验还可以是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-水-四氢呋喃＝70∶25∶10；蒸发光散射检测器，检测参数漂移管温度105摄氏度，载气为氮气，载气流速3.10升/min；理论踏板数按银杏内酯A峰计，应不低于3500。
对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的银杏内酯A、B、K、白果内酯适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量去本品0.5ml于5ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，即得。
测定法精密量取供试品溶液及对照溶液各20μL分别注入液相色谱仪，测定，即得。
经上述方法测定的注射剂当中银杏内酯含量应当复合下述要求组合物G1制剂的中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于4.3mg/ml；组合物G2制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于4.0mg/ml；组合物G3制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于3.2mg/ml；组合物G4制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于2.6mg/ml。
2、银杏黄酮的含量测定用高效液相色谱法测定色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)为流动相；检测波长为370nm；理论塔板数以斛皮素峰计算，应不低于6000。
对照品溶液的制备精密称取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg异鼠李素对照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液。精密吸取适量储备液用甲醇或流动相稀释配成浓度分别为斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，异鼠李素1μg/ml，的对照品溶液。
供试品溶液的制备精密吸取本品5ml于锥形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％盐酸缓慢加热至回流，回流1小时，冷却。溶液转移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
按照上述方法测定的注射剂当中银杏黄酮的含量应当复合以下要求组合物G1制剂中含黄酮甙的总量不低于0.0625mg/ml；组合物G2制剂中含黄酮甙的总量不低于0.14mg/ml；组合物G3制剂中含黄酮甙的总量不低于0.35mg/ml；组合物G4制剂中含黄酮甙的总量不低于0.53mg/ml。
实验例1银杏叶提取物口服药效学研究1本发明银杏内酯和银杏黄酮组合物(以下称银杏叶提取物)口服对小鼠耐缺氧能力的影响取小鼠60只，体重为18-22g，随机分为6组，每组10只，雌雄各半。分别为银杏叶提取物的组合物G1、G2、G3、G4、35.0mg/kg；尼莫地平组(2.0mg/kg)及模型对照组(给以等量的0.5％CMC-Na)。于实验前六天，每天灌胃给药一次，以不同浓度等容积给药0.2ml/10g体重。第七天最后一次给药后一小时，将小鼠置于装有25g钠石灰的150ml密闭广口瓶中，以秒表观察记录小鼠的呼吸停止时间。
表1结果表明银杏叶提取物ig可显著延长小鼠在缺氧状态下的存活时间(P＞0.01)，与尼莫地平相比无显著性差异。
表1银杏叶提取物ig对小鼠耐缺氧能力的影响(n＝10，x±s)

**p＜0.05，***p＜0.012.银杏叶提取物ig对小鼠急性不完全性脑缺血的保护作用取小鼠70只，体重为18-22g，随机分为7组，每组10只，雌雄各半。分别为银杏叶提取物组合物G1、G2、G3、G4 35mg/kg，阳性对照尼莫地平组2mg/kg，假手术组及缺血模型对照组(均给以等量CMC-Na)。于实验前六天，每天给药一次，以不同浓度等容积给药(0.2ml/10g体重)。第七天最后一次给药后，小鼠用乙醚麻醉，切开颈部正中皮肤，钝性分离肌层，暴露两侧颈总动脉，用眼科镊把颈总动脉和动脉鞘内的其他组织分开。给药后1小时后，在分离出的两侧颈总动脉下穿线并结扎(合并迷走神经结扎)。观察结扎后1小时内小鼠的存活数。
结果如表2所示，银杏叶提取物ig能够剂量依赖性的增加急性不完全性脑缺血小鼠的存活数。与模型对照组相比，银杏叶提取物ig 35.0有明显的差异(P＜0.05和P＜0.01＝。与尼莫地平组相比无显著性。
表2银杏叶提取物对抗小鼠急性不完全性脑缺血的作用(n＝10)

**p＜0.05，***p＜0.01试验表明，上述四种银杏叶提取物均具有提高小鼠抗缺氧能力。抗小鼠急性不完全性脑缺血的作用，提高其成活率。揭示四种银杏叶提取物可用于缺血性中风的治疗。
实验例2本发明药物组合物制备的注射剂(本发明称为银杏叶提取物注射剂)的药效学研究。
根据中药新药研究指南，研究银杏叶提取物注射剂治疗缺血性脑损伤的药效学，为临床应用提供实验依据。
一、受试药物1.名称银杏叶提取物注射剂(由本发明药物组合物制备)规格50mg/10ml/支(5mg/ml)。G1中银杏内酯含量为4.39mg/ml，含黄酮甙的总量0.064mg/ml；G2中银杏内酯含量为4.11mg/ml，含黄酮甙的总量0.146mg/ml；G3中银杏内酯含量为3.31mg/ml，含黄酮甙的总量为0.359mg/ml；G4中银杏内酯含量为2.64mg/ml，含黄酮甙的总量为0.538mg/ml。
配制方法静脉注射将该药用提供的溶媒稀释到所需浓度，大鼠实验的药物浓度为0.25％，静脉给药0.6ml/100g。
2.名称银杏叶提取物注射剂溶媒批号000409规格10ml/支
3名称尼膜同注射液(尼莫地平注射液)，德国拜尔出品，批号CATEZ1规格50ml10mg4.名称金纳多注射液，德国舒培大药厂出品，批号6580199，规格17.5mg银杏提取物/5ml/支二、动物SD大白鼠，体重为300-400g，雌雄各半。由中国药科大学动物饲养室提供，合格证号苏动质97004三、试验方法和结果(一)银杏叶提取物注射剂iv对动物脑缺血的保护作用1、银杏叶提取物注射剂iv对大鼠实验性局灶性脑缺血的保护作用1.1银杏叶提取物注射剂iv对局灶性脑缺血大鼠脑功能、梗塞率和脑含水量的影响取雄性SD大鼠90只，体重300-400g，按体重随机分为9组，分别为银杏叶提取物注射剂G1、G2、G3、G4 15.0mg/kg，，溶媒对照组，阳性对照尼膜同注射液组0.2mg/kg，阳性对照金纳多注射液组1.0ml/kg，假手术组及缺血模型对照组(均给以等量生理盐水0.6ml/100g)。于实验前四天，每天尾静脉注射给药一次，第四天最后一次于缺血前30分钟给药。参考Longa等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。大鼠用10％水合三氯乙醛(300mg/kg)ip麻醉，仰卧恒温手术台上颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将尼龙线(长4cm，直径0.26mm)经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进20mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。一小时后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。
术后24h按Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准如下0级未观察到神经症状；1级提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；2级将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；3级动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；4级；软瘫，肢体无自发活动。
MCAO 24h后，断头处死大鼠，取出全脑，左右脑分别切开，称重。在右脑视交叉及其前后各2mm处，做冠状切，脑切片于1％TTC溶液中避光37℃孵育25分钟，用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，计算梗塞百分比如下梗塞百分比(％)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％将染色后的脑组织置于110℃烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑含水量如下脑组织含水量(％)＝(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100％由表3可知，银杏叶提取物注射剂15.0mg/kg iv能使MCAO大鼠的脑卒中评分降低(P＜0.01)，MCAO梗塞范围缩小(P＜0.01)，脑组织含水量减少(P＜0.01)，其高、中剂量作用强度与金纳多比较无明显差异。
表3银杏叶提取物注射剂iv对局灶性脑缺血大鼠神经行为、脑梗塞率和脑含水量的影响(x±s，n＝10)组别 剂量(mg/kg) 神经行为评分脑梗塞率(％) 脑含水量(％)假手术组 -0.2±0.4077.7±0.6模型对照 -3.2±0.821.0±2.381.0±1.7溶媒对照 -3.0±0.8*△△△◇◇◇20.7±2.0*△△△◇◇◇81.1±1.4*△△◇◇◇G1 2.2±0.8**△◇◇17.1±2.5***△◇◇◇79.9±1.6**△◇◇◇G215.0 2.1±0.7**△◇◇16.4±2.4***△◇◇◇79.2±1.2**△◇◇◇G3 2.3±0.5**△◇◇17.4±2.3**△◇◇◇80.1±1.1**△◇◇◇G4 2.2±0.8**△◇◇17.2±2.3***△◇◇◇80.2±1.8**△◇◇◇金纳多组 1.0ml/kg 1.9±0.7**◇◇◇15.6±3.0***◇◇◇78.0±2.1**◇尼膜同组 0.2 1.9±0.7**◇◇◇16.9±1.9***◇◇◇78.4±1.3**◇
*p＞0.05， **p＜0.05， ***p＜0.01vs模型对照△p＞0.05，△△p＜0.05，△△△p＜0.01 vs金纳多组◇p＞0.05，◇◇p＜0.05，◇◇◇p＜0.01 vs假手术组上述实验表明G1，G2，G3，G4均具有改善大鼠局灶性脑缺血神经行为、脑梗塞率和脑含水量的作用，其中以G2效果较佳。
实验例3本发明药物组合物G2制备的注射液(本发明称为银杏酮酯脑心康)对犬脑循环及后肢循环的作用实验目的 观察银杏酮酯(脑心康)注射液静脉注射给药后，对麻醉家犬脑血流量、脑血管阻力、平均动脉压、心率、后肢血流量等的影响。
实验材料1 银杏酮酯(脑心康)注射液银杏酮酯5mg/ml，10ml/支，批号990728，中国药科大学生物制药学院提供；2 家犬家养杂种，健康，体重7～12kg，♀♂兼有(雌性未孕)，本院实验动物中心提供；3 RM-6000型多道生理记录仪日本光电公司产品；4 MFV-3200型电磁血流量计日本光电公司产品；5 0.9％氯化钠注射液100ml/瓶，批号990212，南京小营制药厂生产；6 葛根素注射液规格100mg/2ml，批号981204，浙江康恩贝集团制药有限公司生产。
实验方法将动物随机分为四组，每组6只，♀♂兼有，各组的平均体重为空白对照组8.1+1.7kg；阳性药组8.4+1.4kg；大剂量组9.0+1.0kg；小剂量组8.7+1.1kg。
实验时，先将生理记录仪、电磁血流量计及合适的探头、放大器等连接好，开机预热，调平衡；实验室温度控制在25～28℃，相对湿度40-60％。
家犬称重后，以3.5％的戊巴比妥钠1ml/kg静脉注射麻醉后，将动物仰卧位固定于犬手术台上。颈部、腹股沟处剪毛，以碘酊和75％酒精消毒剪毛区。分离出下肢左侧股动、静脉，股动脉插管并以肝素生理盐水液导与TP-400T型压力换能器习；目连，由RM-6000型多导生理记录仪记录平均动脉压(MAP)；股静脉插管以生理盐水(NS)静脉滴注，滴速约30d/min。颈部正中线切口，分离出气管，进行气管插管，并连接动物人工呼吸机，维持通气。分离出颈总动脉和椎动脉，沿颈总动脉远心端分离出颈外动脉并结扎。分别在颈总动脉和椎动脉上固定适宜口径的电磁血流量计探头，由MFV-3200型电磁血流量计记录颈内动脉和椎动脉的血流量。以止血钳关闭手术区皮肤，并以沾满NS的湿纱布盖住伤口。在动物四肢皮下插入针状电极，描记标准II导联心电图，记录心率。分离出右侧股动脉并固定合适口径的电磁血流量计探头，测定股动脉的血流量。
动物手术后稳定约20min，待颈内动脉、椎动脉及股动脉血流量、血压、心率等指标稳定后，记录上述指标，5min后复测一次，取平均值作为给药前的对照值。然后由左侧股静脉按组分别给药，空白对照组静脉滴注0.9％氯化钠注射液100ml/只，10min左右滴完。阳性对照药用葛根素注射液，剂量为10mg/kg；银杏酮酯(脑心康)注射液大剂量组的剂量为重mg/kg，小剂量组的剂量为0.5mg/kg。阳性药及银杏酮酯(脑心康)注射液均将药液混入100ml的0.9％氯化钠注射液中由股静脉快速静脉滴注给药，10min左右滴完。给药后5、10、20、30、60、120min复测上述各指标。实验结束后，处死动物，取全脑称重，其1/2作为一侧脑重。依下列公式计算脑血流量和脑血管阻力脑血流量(ml/100g·min)＝(颈内动脉血流量+椎动脉血流量)(ml/min)×100(g)/-侧脑重(g)脑血管阻力(kPa·100g·min/ml)＝血压(kPa)/脑血流量(ml/100g·min)实验结果进行给药前后配对t-检验统计学处理。
实验结果(见表4，表5)表4可见，麻醉犬静脉注射0.9％NaCl注射液后，脑血流量呈下降趋势，脑血管阻力有增加趋势，但无统计学显著性差异(P＞0.05)。静脉注射银杏酮酯(脑心康)注射液后，脑血流量明显地增加(P＜0.05～0.001)，脑血管阻力明显下降(P＜0.05～0.001)，药效作用维持1h以上，给药2h后基本恢复到正常水平(P＞0.05)。阳性药(葛根素注射液)也有同样的作用，但维持1h后基本恢复到正常水平。各组动物的血压和心率则未见显著性改变。表明银杏酮酯(脑心康)注射液可以明显增加麻醉犬脑部的供血，减少脑血管阻力。
由表5可见，银杏酮酯(脑心康)注射液静脉注射给药后，麻醉犬的股动脉血流量有短时间的明显升高，其中大、小剂量组给药后5～30min均有明显的增加(P＜0.05～0.001)，60min时也有增加趋势(但无统计学差异，P＞0.05)，其后恢复接近正常。而葛根素注射液给药后，犬的股动脉血流量在5～30min内呈增加趋势，但无统计学差异(P＞0.05)，60min后，有下降的趋势。空白对照组犬的股动脉诱因流量未见明显的改变(P＞0.05)。
表4 银杏酮酯(脑心康)注射液对麻醉犬脑循环的影响(x±s，n＝6)组别 时间 脑血流量 脑血管阻力(×10-2) 血压心率(min)(ml/100g·min)(kPa 100g·min/ml)(kPa) (beats/min)给药前 334.0±103.2 5.16±1.3716.12±2.20 187.2±24.2空 5346.2±106.0 4.99±1.3816.12±2.28 191.0±24.0白 10 332.5±99.2 5.07±1.4915.93±2.28 92.2±24.2对 20 318.0±105.4 5.44±1.5516.02±2.44 193.5±24.0照 30 307.2±117.7 5.70±1.8315.93±2.41 192.2±23.2组 60 301.1±121.4 5.68±1.7915.43±2.38 192.8±25.6120 288.4±121.8 5.95±1.8815.56±2.66 192.8±25.6给药前 329.4±91.6 5.29±1.6716.25±1.34 167.0±27.0阳 5517.0±182.2**3.45±1.16** 16.27±1.18 164.5±25.7性 10 505.3±165.6**3.54±1.14** 16.45±1.22 164.8±26.9对 20 442.0±110.9*** 3.93±0.93** 16.55±1.27 164.7±25.5照 30 420.8±85.1***4.03±0.88* 16.236±1.22163.5±25.1组 60 369.0±75.6* 4.62±1.1416.35±1.25 159.7±26.2120 302.8±86.6 5.87±2.0016.42±1.54 159.5±31.0大 给药前 311.3±118.6 5.17±1.3714.95±3.07 183.5±21.2剂 5446.9±210.8* 3.83±1.24* 15.07±2.97 181.5±21.0量 10 443.4±188.0* 3.76±1.15** 15.08±3.01 182.3±16.0
组 20 417.1±159.5**3.86±1.14** 14.91±3.01185.0±18.930 409.2±145.1**4.02±1.32***15.14±2.64186.2±22.860 370.2±112.2 4.33±1.36* 15.01±3.07183.2±19.5120 299.1±99.7 5.36±1.37 15.13±2.87191.8±21.8给药前 300.3±94.3 5.75±1.51 16.17±1.53196.8±29.5小 5 488.2±102.8**3.39±1.00** 15.84±1.84188.7±28.6剂 10 481.0±126.5**3.56±1.29** 15.96±1.73190.8±30.7量 20 437.1±124.5**3.97±1.63** 15.92±1.82190.8±31.7组 30 405.3±117.4**4.18±1.69* 15.56±1.73190.3±31.360 384.2±102.9* 4.35±1.29* 15.72±1.39189.3±33.1120 310.8±92.6 5.64±2.26 15.93±1.14183.5±25.7注与给药前的净增减值比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表5 银杏酮酯(脑心康)注射液对股动脉血流量的影响(x±s ml/min，n＝6)时间空白对照组阳性药组 大剂量组小剂量组(min)给药前 36.3±9.9 37.3±19.045.2±14.3 34.0±13.55 37.0±9.8 62.3±44.569.8±20.3* 66.7±23.0**10 36.0±11.360.8±41.868.0±15.5**60.0±16.920 33.5±11.750.3±29.363.3±10.9* 54.7±13.8***30 32.5±11.747.2±29.561.8±10.9* 52.0±17.3**60 32.3±12.236.8±20.056.7±14.8 47.3±23.6120 35.0±13.527.8±13.850.3±21.8 39.2±22.3注与给药前的净增减值比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实验例4血小板聚集性及血液流变性试验报告实验目的观察银杏酮酯(脑心康)注射液对血瘀模型家兔的血小板聚集性和血液流变性的影响。
实验材料1动物新西兰白兔，♀♂各半，体重2.2～2.5kg，购于省农科院种畜场，合格证号苏动(质)9812002银杏酮酯(脑心康)注射液含银杏酮酯5mg/ml，中国药科大学生物制药学院提供，批号990715；3葛根素注射液含葛根素0.1g/2ml，批号981204，浙江康恩贝集团制药有限公司生产4高分子右旋糖酐平均分子量236000，上海长征制药厂，以注射用生理盐水加热配成10％。
5血小板聚集仪，LBY-NJ2型，北京普利生公司产6旋转式锥板粘度仪，LBY-N6A+型，北京普利生公司产。
7血小板活化因子(PAF)1mg/支，批号99H7001，美国SIGMA公司生产。
实验方法和结果家兔36只，随机分为6组，每组6只，♀♂各半，分别为空白对照组、模型对照组、阳性药对照组及银杏酮酯(脑心康)注射液大、中、小剂量组。各组动物先耳缘静脉注射(iv)给药。空白及模型对照组注射生理盐水(NS)1ml/ks，阳性药组iV葛根素注射液30mg/kg(以NS配成30mg/ml)，银杏酮酯(脑心康)注射液大、中、小剂量组分别注射含银杏内酯1、0.5、0.25mg/ml的药液(以NS配成)，给药量2ml/kg，连续给药两周(14天)，于给药的第12、13天，除空白对照组外，各兔分别注射10％高分子右旋糖酐5ml/Kg，每日两次，造成“血瘀”模型。末次给药1h后，再次注射10％高分子右旋糖酐5ml/Kg，15min后，心脏采取空腹血6ml，2ml置于含109mmol/L枸橼酸钠(9∶1)的试管供测定血小板聚集率(用LBY-NJ2型血小板聚集仪，采用比浊法，以900umol/L的PAF作诱导剂)，4ml置肝素抗凝管供测定全血粘度(用LBY-N6A+旋转式锥板粘度仪，切变率为8、10、20、40、60、80、100、120s-1)、血浆粘度、红细胞压积、血沉、纤维蛋白原等指标，并计算出全血还原粘度、红细胞刚性指数、红细胞聚间t-检验统计学处理。结果如下(见表6～11)。
表6 银杏酮酯(脑心康)对家兔血小板聚集和纤维蛋白原的影响(x±s，n＝6)组别 剂量 体重 血小板聚集率 纤维蛋白原(mg/kg)(kg) (％) (g/L)空白组/ 2.32±0.15 15.56±2.48**2.53±1.16模型组/ 2.47±0.08 39.27±15.07 2.73±1.42阳性药组 30 2.37±0.12 12.74±3.47**3.12±1.932 2.42±0.12 12.97±3.29**2.86±2.15脑心康组 1 2.42±0.13 13.28±3.16**2.40±1.870.52.33±0.15 13.86±2.38**2.60±0.94注与模型组比较**P＜0.01。
表7 银杏酮酯(脑心康)注射液对家兔全血粘度的影响(mPa.s，x±s，n＝6)组别 剂量 切变率(l/s)mg/kg8 102040空白组/5.45±1.02** 5.09±0.86** 4.17±0.63** 3.54±0.47**模型组/14.05±4.83 12.42±4.21 8.84±3.066.95±2.42阳性药组 30 7.61±1.53* 7.14±1.59* 5.54±0.89* 4.33±0.32*27.28±2.22* 6.84±2.03* 5.41±1.47* 4.42±1.07*脑心康组 110.27±4.94 9.33±4.447.80±4.515.54±1.870.5 8.21±2.42* 7.63±2.186.26±1.754.68±1.17注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表8 银杏酮酯(脑心康)注射液对家兔全血粘度的影响(mpa.s，x±s，n＝6)组别 剂量 切变率(l/s)mg/kg6080 100 120空白组/3.30±0.43** 3.23±0.45* 3.00±0.32* 2.83±0.31*模型组/5.93±1.875.38±1.79 5.11±1.69 4.92±1.72阳性药组 30 3.89±0.27* 3.62±0.28* 3.46±0.26* 3.28±0.25*24.01±0.92* 3.78±0.83 3.62±0.80 3.45±0.79脑心康组 14.85±1.274.46±1.06 4.22±0.93 3.97±0.850.5 4.24±1.003.95±0.90 3.77±0.86 3.57±0.84
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表9 银杏酮酯(脑心康)对家兔血浆粘度、红细胞压积及血沉等的影响(x±s，n＝6)组别 剂量血浆粘度 红细胞压积血沉 血沉方程K值mg/kg mPa.s ％mm/h空白组/ 1.12±0.08*** 44.47±3.93 3.22±3.12*** 12.39±12.00***模型组/ 1.61±0.16 44.42±8.36 31.92±8.69126.55±35.78阳性药组 30 1.51±0.26 42.00±11.69 33.72±16.16 110.97±30.722 1.81±0.46 43.17±6.98 24.03±6.9791.86±40.64脑心康组 1 1.53±0.26 44.00±5.42 25.25±12.69 103.58±65.430.5 1.61±0.16 41.38±6.19 22.10±15.89 65.21±40.48*表10 银杏酮酯(脑心康)注射液对家兔全血还原粘度的影响(x±s，n＝6)组别 剂量低切 中切 高切mg/kg 切变率8s-1切变率40s-1切变率120s-1空白组/ 9.67±1.54** 5.43±0.63* 3.83±0.41*模型组/ 28.16±11.67 12.00±5.52 7.23±2.84阳性药组 30 15.37±5.51* 6.77±1.25* 4.31±0.992 12.81±4.52* 6.08±2.20* 3.79±1.77*脑心康组 1 19.47±9.199.02±3.505.61±2.110.5 16.08±5.617.55±2.664.81±1.79表11 银杏酮酯(脑心康)对家兔红细胞聚集性的影响(x±s，n＝6)剂量组别 聚集指数 刚性指数变形指数电泳指数mg/kg空白组 / 1.92±0.22** 3.44±0.42 0.70±0.05 4.33±0.46*模型组 / 2.90±0.70 4.62±2.15 0.78±0.16 6.76±2.14阳性药组 302.34±0.55 2.95±0.88 0.65±0.15 5.96±2.2422 2.08±0.22*2.28±1.25* 0.53±0.20* 4.94±0.9611 2.50±0.83 3.79±1.62 0.72±0.19 5.62±1.270.5 0.5 2.28±0.21 2.94±0.81 0.66±0.12 5.57±0.60
结果表明银杏酮酯(脑心康)注射液能明显改善血瘀模型家兔的血液流变性，以大、中、小三个剂量组血小板聚集性下降最为明显(P＜0.01)。大剂量组的全血粘度(切变率8、10、20、40、60s-1)和全血还原粘度(高、中、低切)明显下降(P＜0.05)，小剂量组的全血粘度在切变率8、10s-1时亦明显下降(P＜0.05)，全血还原粘度(低切)和血沉方程K值也明显下降(P＜0.05)。大剂量组的红细胞聚集、刚性、变形指数等也明显下降。
实验例5银杏酮酯(脑心康)注射液对大白鼠离体心脏灌流的影响实验目的 观察银杏酮酯(脑心康)注射液对大白鼠离体心脏灌流的作用。
实验材料1银杏酮酯(脑心康)注射液2ml/支，含银杏酮酯5mg/ml，批号9907028，中国药科大学生物制药学院提供。
2银杏酮酯(脑心康)注射液溶媒含丙二醇45％。聚乙二醇40020％.pH6.83 0.05mol/L 35％，中国药科大学生物制药学院提供；3葛根素注射液2ml100mg，批号981204，康恩贝集团制药有限公司制造；4垂体后叶素注射液1ml10u，批号981221，上海第一生化药业公司上海生物化学制药厂生产；5改良K-H液等所用试剂均为市售AR级；6仪器改良的Langendorff离体心脏灌流装置；DC-001型离体器官测定仪，南京分析仪器厂；501型超级恒温水浴，中国重庆仪器设备厂；7动物SD种健康大白鼠，兼有，体重250-350g，购于南京中医药大学实验动物中心，合格证号苏动(质)第97028号。
实验方法1对正常大白鼠离体心脏灌流的影响将大白鼠随机分为六组，每组8只，♀♂兼有，即(1)空白对照组(NS0.1ml)；(2)葛根素对照组(5mg)；(3)银杏酮酯(脑心康)注射液大剂量组(0.6mg)；(4)银杏酮酯(脑心康)注射液中剂量组(0.3mg)；(5)银杏酮酯(脑心康)注射液小剂量组(0.15mg)；(6)银杏酮酯(脑心康)注射液溶媒对照组(0.1ml)。采用改良的Langendorff大白鼠心脏灌流装置进行离体心脏灌流试验。离体心脏固定在灌流装置上后，即用37℃的K-H液灌流20～30分钟，记录心率(HR)、冠脉流量(CBF)及收缩幅度(AC)等指标，作为给药前对照，用微量注射器在灌流管下端缓慢注射药液0.1ml，空白组注入NS 0.1ml，1分钟内给完，记录给药后的3、6、9、12、15、18、30min的上述各项指标。
结果显示①银杏酮酯(脑心康)注射液对正常大白鼠离体心脏心率(HR)的作用给药后银杏酮酯(脑心康)注射液各组与空白组比较无统计学意义，大剂量组给药后3min与给药前自身比较有降低(P＜0.05)阳性药葛根素组心率给药后与空白组比较无统计学差异，与给药前比较略有增加；溶媒组与空白组比较无统计学差异(表12)。②对冠脉流量(CBF)的作用银杏酮酯(脑心康)注射液各组与空白组比较无统计学意义，与给药前比较大剂量组及小剂量组18、30min明显下降(P＜0.05～0.001)；葛根素组与空白组比较药后冠脉流量有所增加但无统计学意义，给药后9、18min与给药前自身比较明显增高(P＜0.05)；溶媒组与空白组组比较无统计学差异，与给药前比较15、30min时明显下降(P＜0.05)(表13)o③对收缩幅度(AC)的作用给药后银杏酮酯(脑心康)注射液各组与空白组比较无统计学差异，大剂量组3min与给药前比较明显增大(P＜0.05)；葛根素组、溶媒组给药后与空白组比较无统计学差异，给药前后自身比较均无统计学差异(表14)。
2对垂体后叶素所致大白鼠心肌缺血模型离体心脏的影响将大白鼠随机分为六组，每组8只，♀♂兼有，即(1)空白对照组(NS0.1ml)(2)垂体后叶素(0.1ml)造模组；(3)葛根素+垂体后叶素组(5mg/0.1ml)；(4)银杏酮酯(脑心康)注射液大剂量+垂体后叶素组(0.6mg/0.1ml)；(5)银杏酮酯(脑心康)注射液中剂量+垂体后叶素组(0.3mg/0.1ml)；(6)银杏酮酯(脑心康)注射液小剂量+垂体后叶素组(0.15mg/0.1ml)。方法同前。改良K-H液灌流20分钟，待各项指标稳定后用微量注射器向灌流液中注入药液，同时注入垂体后叶素(1个单位)，1分钟内给完，造成心肌缺血模型，记录给药后3、6、9、12、15、18、30min各项指标。模型组以NS 0.1ml代替药液。
结果显示垂体后叶素可使离体心脏的心率减慢，3min明显降低(P＜0.01)，同时自身前后比较3、6min时有统计学改变(P＜0.05～0.01)；冠脉流量明显减少，组间比较与自身前后比较均有下降(P＜0.05～0.001)；心收缩幅度略有增加，但无统计学差异。①对心肌缺血模型心率的作用银杏酮酯(脑心康)注射液+垂体后叶素各组给药后心率均有增加，但与模型组比较无统计学差异，大、中、小三个剂量组3min与给药前自身比较明显减慢(P＜0.05～0.001)；葛根素+垂体后叶素组给药后与模型组比较心率增加，6min、9min时明显增加(P＜0.05)，与给药前自身比较3、6、9、12、15min明显增加(P＜0.05～0.01)(表15)。②对心肌缺血模型冠脉流量的作用银杏酮酯(脑心康)注射液+垂体后叶素各组的冠脉流量均有增加，其中大剂量+垂体后叶素组6、9、12、15、18min，中剂量+垂体后叶素组6min及小剂量组+垂体后叶素组6、12min与模型组比较有显著差异(P＜0.05～0.01)，大剂量+垂体后叶素组3min，中剂量+垂体后叶素组3、6min及小剂量+垂体后叶素组3、6、30min与给药前自身比较明显减少(P＜0.05～0.001)；葛根素+垂体后叶素组给药后与模型组比较可明显增加冠脉流量(P＜0.05)，与给药前自身比较3min明显减少(P＜0.05)。③对心肌缺血模型心肌收缩幅度的作用银杏酮酯(脑心康)注射液+垂体后叶素各组给药后与模型组比较无统计差异，大剂量+垂体后叶素3min。中剂量+垂体后叶素组3、12、15、18min，小剂量+垂体后叶素组3、6、18min与给药前自身比较明显增加(P＜0.05～0.01)，而中剂量+垂体后叶素给12、15、18min与给药前自身比较明显下降p＜0.05。
表12银杏酮酯(脑心康)注射液对大白鼠离体心脏心率的影响(x±s，n＝8)组别 药前 药后(净增减值)bpm3 6 9 12 15 18 30空白组223.5±41.0 2.1±24.7-5.5±13.6 -5.0±17.6 -20.3±35.9 -7.5±14.2 -7.3±16.4 -9.6±16.5葛根素组 231.9±22.1 6.6±17.4-2.9±16.9 6.1±12.1 3.0±9.9 6.5±9.83.1±21.7 0.6±19.4大剂量组 211.8±26.8 -20.0#±21.1 -7.3±15.5 -5.8±11.6 -5.8±12.9 -8.8±13.4 -8.8±13.3 -10.8±17.8中剂量组 211.5±29.8 -6.8±20.4-7.5±24.2 -0.9±17.2 -0.5±18.5 -3.9±30.1 -4.0±32.1 -4.0±35.5小剂量组 224.6±34.2 -21.6±32.0 -5.9±19.3 1.9±25.1 1.4±25.00.9±18.0 -8.1±17.7 -9.6±23.8溶媒组205.4±24.0 -13.6±40.71.7±18.1 1.8±16.8 7.3±20.70.3±15.6 -0.7±21.1 -10.2±35.5
注与给药前自身比较#P＜0.05表13 银杏酮酯(脑心康)注射液对大白鼠离体心脏冠脉流量的影响(x±s，n＝8)组别 药前 药后(净增减值)bpm3 6 9 12 15 18 30空白组 19.9±2.6 -0.3±1.2 0.5±1.1 -0.2±1.6 -0.2±3.9 0.4±4.30.6±3.4 0.4±3.8葛根素组 18.3±3.6 1.9±1.9 1.7±2.2 1.8#±1.8 0.8±1.5 1.4±1.81.6#±1.71.4±2.2大剂量组 17.6±3.2 -1.5±1.9 0±0.9 0±1.5-0.5±1.2 -0.9±1.6 -0.9#±0.9 -1.4#±1.3中剂量组 18.3±4.6 -1.2±5.3 0.6±2.3 0.4±2.3 0±2.2-0.2±2.86.0±2.6 0.4±3.3小剂量组 16.8±3.1 -2.3±4.1 -1.0±2.3 -1.0±1.3 -1.8±6.5 -1.3±4.2 -1.8##±1.3 -2.4###±0.9溶媒组 18.1±3.9 -0.7±2.7 -0.7±1.7 0±1.3-0.1±1.1 -0.8#±0.9 -0.6±1.5-1.1#±1.2注与给药前自笛比较，#P＜0.05；##P＜0.01；###P＜0.001表14 银杏酮酯(脑心康)注射液对大白鼠离体心脏心肌收缩心率的影响(x±s，n＝8)组别 药前 药 后 净增减值mm3 6 9 12 15 18 30空白组16.8±4.0 1.1±2.90.3±2.10.8±2.5 0.8±2.9 1.6±2.1 1.9±2.6 1.9±2.4葛根素组 17.6±4.1-0.7±3.4 -1.6±10.0 -1.1±4.9 -0.8±6.1 0.1±5.1 -0.2±2.7 -0.3±3.1大剂量组 14.9±5.5 2.1#±2.2 1.1±2.20.6±1.6 1.5±3.3 1.3±2.9 1.9±3.9 2.4±4.6中剂量组 18.3±9.1 0.6±1.5 -0.6±2.70±2.6-0.8±2.5 -0.4±3.6 -0.8±3.3 -1.6±4.6小剂量组 14.0±8.3 3.3±5.10.8±2.0 -0.8±4.8 -1.0±4.7 -0.3±4.3 3.4±3.9 -0.9±3.3溶媒组19.5±5.5-2.2±3.6 -0.8±2.4 -0.2±3.4 -0.4±4.2 -1.0±2.9 1.2±3.5 1.7±4.8注与给药前自身比较#p＜0.05表15 银杏酮酯(脑心康)注射液对缺血大白鼠离体心脏心率的影响(x±s，n＝8)组别 药前 垂体后叶素+药物 净增减值 bmp3 69 12 15 18 30空白组 223.5±41.0 2.1？**±24.7 -5.5±13.6 -5.0±17.6 -20.3±35.9 -7.5±14.2 -7.3±16.4 -9.6±16.5垂体后叶素组 226.8±28.8 -53.6##±35.4 -22.6#±23.5 -13.4±26.7-0.1±17.5 -0.9±32.4 -8.4±14.6 -32.9±23.9葛根素+垂体后叶素 214.0±20.6 -36.54##±29.1 6.0±#*25.3 17.5#*±16.4 17.0#±16.3 9.8#±10.9 3.3±14.0 5.5±11.5大剂量组+垂体后叶素组 198.9±21.8 -75.4###±16.6 -7.6±22.12.1±118.42.6±17.10.6±17.3 1.9±16.6 2.6±10.3中剂量组+垂体后叶素组 217.5±31.6 -50.25#±49.7 -12.0±18.7 -1.3±12.0 7.0±17.08.5±19.9 10.8±18.9 6.8±13.9小剂量组+垂体后叶素组 225.1±27.2 -84.4##±48.4 -28.4±37.6 -0.6±33.3 4.6±33.30.9±37.1 1.4±33.8 -6.1±34.2
注与给药前自身比较#p＜0.05；##p＜0.01；###p＜0.001；与模型组比较，*p＜0.05；**p＜0.01小结1银杏酮酯(脑心康)注射液对正常大白鼠离体心脏的作用银杏酮酯(脑心康)注射液对正常大白鼠离体心脏的心率、冠脉流量、心肌收缩幅度与空白组比较无明显作用。但大剂量组给药后3min心率比药前减慢(P＜0.05)，6min后心率恢复正常；大、小剂量组药后18～30min冠脉流量比给药前减少(P＜0.05～0.001)；大剂量组药后3min心肌收缩幅度比药前增加(P＜0.05)。
2银杏酮酯(脑心康)注射液对垂体后叶素造成心肌缺血模型的作用银杏酮酯(脑心康)注射液对垂体后叶素造成心肌缺血模型具有增加心率，增加冠脉流量等作用。银杏酮酯(脑心康)注射液+垂体后叶素各剂组给药6min后心率略有增加，与模型组比较无统计学差异；大、中、小三个剂量组给药后3min与造模前比较心率减慢(P＜0.05～0.00 1)。银杏酮酯(脑心康)注射液+垂体后叶素各剂组给药后冠脉流明显增加，与模型组比较大剂量组6、9、12、15、18min，中剂量组6min，小剂量组6、12min均有显著差异(P＜0.05-0.001)；与造模前比较大剂量组3min、中剂量组3、6min、小剂量组3、6、30min冠脉流量明显减少(P＜0.05～0.001)。银杏酮酯(脑心康)注射液+垂体后叶素各剂组给药后与模型组比较无统计学差异；与造模前比较大剂量组3min、中剂量组3min、小剂量组3、6、18min心肌收缩幅度明显增加(P＜0.05-0.01)，而十剂量组12、15、1groin则减少(P＜0.05)。
实验例6银杏酮酯(脑心康)注射液对小白鼠耳廓微循环的影响实验目的 观察银杏酮酯(脑心康)注射液对小白鼠耳廓微循环的作用。
实验材料银杏酮酯(脑心康)注射液2ml/支，含银杏酮酯5mg/ml，批号9907028，中国药科大学生物制药学院提供；丹参注射液2ml3g，批号980703，上海中西药业股分有限公司；动物昆明种小白鼠，体重22±2g，♀♂兼有，健康，购于南京药械厂实验动物中心，合格证号苏动(质)97012；
仪器Olympus-BH显微电视录象系统，日本(组装)。
实验方法与结果实验用小白鼠40只，♀♂兼有，随机分为五组，即(1)空白对照组(NS0.1ml)；(2)阳性药(丹参注射液)对照组(7.5g/kg)；(3)银杏酮酯(脑心康)注射液大剂量组(15.0mg/kg)(4)银杏酮酯(脑心康)注射液中剂量组(7.5mg/kg)；(5)银杏酮酯(脑心康)注射液小剂量组(3.75mg/kg)。药物以NS稀释至0.1ml并温热至37℃后，尾静脉注射给药。
小白鼠以25％乌拉坦0.1ml/10g腹腔麻醉，分别记录给药前及给药后5、10、20、30min时耳廓部的微动、静脉管径及血色、流态等微循环指标。
结果显示银杏酮酯(脑心康)注射液大、中、小剂量组在药后5～30min微动脉管径有显著扩张(P＜0.05～0.01)；微静脉管径大剂量组20、30min，中剂量组5、10、20rain都有显著扩张(P＜0.05～0.01)。(详见表16)。小白鼠耳廓微血管血色及流态无明显改变。
表16 对小白鼠耳廓微动静管径的影响(x±s，n＝8)组别 剂量 药后(净增减值)(g/kg) 5min 10min 20min 30min空白组等积NSA -0.1±0.14-0.13±0.18-0.15±0.28-0.13±0.25V -0.01±0.060.01±0.06-0.01±0.06-0.04±0.07阳性药组 7.5 A0.06±0.180.18±0.29*0.06±0.12 0.11±0.15*V0±0.18 0.08±0.19-0.01±0.29 0.05±0.17大剂量组 0.015 A0.29±0.34*0.21±0.29*0.33±0.32**0.25±0.23**V0.1±0.18 0.16±0.26 0.23±0.23*0.23±0.23*中剂量组 0.0075A0.1±0.13*0.18±0.21**0.18±0.23*0.14±0.23*V0.24±0.29*0.31±0.3*0.27±0.21**0.2±0.32小剂量组 0.0033A0.14±0.21*0.16±0.20**0.21±0.20*0.16±0.16*V0.05±0.090.14±0.24 0.08±0.21 -0.01±0.22注与空白组比较，*p＜0.05；**p＜0.01。
小结实验结果表明奶杏酮酯(脑心康)注射液具有扩张小白鼠耳廓微动、静脉管径，改善微循环，从而增加局部血流量的作用。
具体实施例方式
实施例1以19∶1的比例取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物，并将其混合，取上述混合物100g，加入淀粉50g、糊精50g，充分混匀，用乙醇制粒，压片。制成片剂。
实施例2以8∶1的比例取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物，并将其混合，取上述混合物100g备用；取PEG400276.0g置适宜容器内，加入PEG60006.0g，水浴加热至PEG6000溶解，搅匀，加入甘油18.0g，加入上述混合物100g，用胶体磨研磨成均匀的膏体，转移至软胶囊机的贮料桶，用约0.3ml的模具压制成软胶囊。
实施例3以8∶1的比例取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物，并将其混合，取上述混合物5.0g备用；取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高压灭菌30min，取出后于10000级配料室加热至80℃，加入研细过80目筛的本发明上述混合物5.0g，加热至溶解，冷却至室温后用10％的柠檬酸水溶液调pH至8.0，加入注射用NaCl8.0g，加注射用水调至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，熔封，质检，印字，包装。
实施例4以8∶1的比例取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物，并将其混合，取上述混合物5.0g备用；取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高压灭菌30min，取出后于10000级配料室加热至80℃，加入研细过80目筛的本发明上述混合物5.0g，加热至溶解，冷却至室温后用10％的柠檬酸水溶液调pH至8.0，加入注射用NaCl 8.0g，加入20g甘露醇作为支架剂，溶解后加注射用水调至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂。
实施例5以5∶2的比例取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物，并将其混合，取上述混合物6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml、pH6.8的磷酸盐缓冲溶液350ml，充分混匀，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂。
实施例6以4∶3的比例取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物，并将其混合，取上述混合物6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量1000ml，于100级无菌车间用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂，质检，印字，包装。
实施例7以4∶3的比例取银杏内酯提取物和银杏黄酮提取物，并将其混合，取上述混合物8.0g，加入用注射用水配制的3.5％乙醇溶液溶解，加3.5％乙醇溶液调至总量10000ml，用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装100ml输液，即得。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于包括下述重量比的组份银杏内酯∶银杏黄酮＝(19-4)∶(1-3)。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于银杏内酯与银杏黄酮的比例是(15-5)∶(1-2)。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于银杏内酯与银杏黄酮的比例是(10-8)∶(1-2)。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于银杏内酯与银杏黄酮的比例是下述一组配比中的任何一种19∶1；8∶1；5∶2；4∶3。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的银杏内酯是按照下述方法精制获得取银杏内酯粗品，加8倍量乙醇，50～60℃水浴，搅拌溶解，过滤，滤液浓缩至总量的八分之一至四分之一，静置，冷却，析晶，过滤，重复上述操作，直至经检验本品中银杏内酯各成分符合要求，取晶体减压低温干燥，即得。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述银杏内酯当中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于90.0％。
7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述银杏内酯当中各成分的含量如下银杏内酯A30％～40％银杏内酯B50％～60％银杏内酯k不低于0.5％白果内酯不低于0.5％。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于所制备的银杏内酯当中银杏酸含量不得高于0.0005％。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述的银杏黄酮是按照下述方法精制获得取银杏黄酮粗提取物，加95％乙醇在60摄氏度水浴中溶解，先通过沙芯漏斗过滤，再经过10000分子量以下超滤膜超滤，收集滤液，60摄氏度减压浓缩，40～50摄氏度真空干燥，即得。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所说的银杏黄酮提取物当中黄酮甙的总量不低于25％。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于所说银杏黄酮当中各黄酮甙的含量范围是斛皮素12～18％，山柰酚7～13％，异鼠李素1～4％。
12.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所说的银杏黄酮提取物当中银杏酸的含量不得高于0.0005％。
13.权利要求1所述药物组合物，其特征在于还含有药物赋形剂，其剂型是口服制剂或者注射剂。
14.根据权利要求13所述药物组合物制剂，其特征在于当组合物中银杏内酯与银杏黄酮的比例是19∶1时，组合物制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于85.0％，含黄酮甙的总量不低于1.25％。
15.根据权利要求13所述药物组合物制剂，其特征在于当组合物中银杏内酯与银杏黄酮的比例是8∶1时，组合物制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于80.0％，含黄酮甙的总量不低于2.8％。
16.根据权利要求13所述药物组合物制剂，其特征在于当组合物中银杏内酯与银杏黄酮的比例是5∶2时，组合物制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于64.0％，含黄酮甙的总量不低于7.0％。
17.根据权利要求13所述药物组合物制剂，其特征在于当组合物中银杏内酯与银杏黄酮的比例是4∶3时，组合物制剂中银杏内酯A、B、K和白果内酯含量之和应高于51.0％，含黄酮甙的总量不低于10.5％。
18.权利要求13口服药物制剂的制备方法，其特征在于取权利要求1-12所述的任何一种组合物，加入淀粉、糊精，充分混匀，用乙醇制粒，干燥，制成硬胶囊、片剂、颗粒剂；或取PEG400置适宜容器内，加入，水浴加热至溶解，搅匀，加入甘油，加入权利要求1-6所述的任何一种组合物，用胶体磨研磨成均匀的膏体，转移至软胶囊机的贮料桶，用模具压制成软胶囊或制成其他口服制剂。
19.权利要求18所述的口服药物制剂的制备方法，其特征在于取权利要求1-12所述的任何一种组合物100g，加入淀粉、糊精50～200g，充分混匀，用乙醇制粒，干燥，制成硬胶囊或片剂；或者取PEG400276.0g置适宜容器内，加入PEG60006.0g，水浴加热至PEG6000溶解，搅匀，加入甘油18.0g，加入权利要求1-6所述的任何一种组合物100g，用胶体磨研磨成均匀的膏体，转移至软胶囊机的贮料桶，用约0.3ml的模具压制成软胶囊或制成其他口服制剂。
20.权利要求18或19所制备口服制剂的鉴别方法，其特征在于该方法包括(1)、鉴别取口服制剂1g，溶于10ml甲醇，取1滴滴于滤纸上吹干后喷洒10％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置365nm紫外灯下观察，呈黄色荧光；取口服制剂，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作为供试品溶液，另取银杏内酯A、B、C、K和白果内酯对照品各1mg分别加甲醇1ml溶解，按照薄层色谱法，用微量点样器分别取上述供试品和对照品溶液各10μL点样于同一块含4％醋酸钠的0.5％CMC-Na溶液制成的硅胶GF254薄板上，以石油醚∶丙酮∶甲醇10∶2.5∶0.3为展开剂，上行展开后，取出，吹干，于160℃加热30分钟，置紫外灯365nm下检视，供试品与对照品应在对应位置上显示相同颜色的斑点；(2)、含量测定a.银杏内酯的含量测定照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VI D)测定，色谱条件与系统适应性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以异丙醇-甲醇-水(8∶24∶80)为流动相，检测波长220nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000，各相邻峰之间的分离度及拖尾因子应符合要求；银杏内酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验还可以是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇-水-四氢呋喃＝70∶25∶10；蒸发光散射检测器，检测参数漂移管温度105摄氏度，载气为氮气，载气流速3.10升/min；理论踏板数按银杏内酯A峰计，应不低于3500；对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的银杏内酯A、B、K、白果内酯适量，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得；供试品溶液的制备精密称取本品100mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得；测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，测定，即得；b、银杏黄酮的含量测定用高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸(52∶48∶0.1)为流动相；检测波长为370nm；理论塔板数以斛皮素峰计算，应不低于6000；对照品溶液的制备精密称取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg异鼠李素对照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液。精密吸取适量储备液用甲醇或流动相稀释配成浓度分别为斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，异鼠李素1μg/ml，的对照品溶液；供试品溶液的制备精密称取本品100mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，过滤，精密吸取5ml于锥形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％盐酸缓慢加热至回流，回流1小时，冷却。溶液转移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
21.权利要求13所述注射剂的制备方法，其特征在于该方法选自下述方法当中的一种取葡甲胺，加注射用水溶解，高压灭菌，取出后加热至80℃，加入权利要求1-6的任何一种组合物，加热至溶解，冷却至室温后用10％的柠檬酸水溶液调pH至8.0，溶解后加注射用NaCl，加注射用水调至总量，微孔滤膜过滤，分装，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化钠等其中之一作为支架剂，分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；或者取权利要求1-6的任何一种药物组合物，加入丙二醇、PEG400、pH6.8的磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量，微孔滤膜过滤，分装，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化钠等其中之一作为支架剂，溶解后一起分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；或者取权利要求1-6的任何一种药物组合物，加入丙二醇、PEG400及4％Na2HPO4·12H2O溶液，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量，微孔滤膜过滤，分装，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化钠等其中之一作为支架剂，溶解后分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；或者取权利要求1-6的任何一种药物组合物，加入2％～10％乙醇溶液溶解，加2％～10％乙醇溶液调至总量，微孔滤膜过滤，分装，即得。
22.权利要求21所述注射剂的制备方法，其特征在于该方法选自下述方法当中的一种取葡甲胺5.0g加注射用水1000ml溶解，于121℃高压灭菌30min，取出后于10000级配料室加热至80℃，加入研细过80目筛的权利要求1-6的任何一种组合物5.0～6.0g，加热至溶解，冷却至室温后用10％的柠檬酸水溶液调pH至8.0，加入注射用NaCl 8.0g，加注射用水调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，即得，或者加入葡萄糖、甘露醇、氯化钠等其中之一作为支架剂，支架剂的量相当于药物组合的1～4倍，溶解后分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；或者取权利要求1-6的任何一种组合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml、pH6.8的磷酸盐缓冲溶液350ml，充分混匀，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，即得，或者分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；或者取权利要求1-6的任何一种组合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，即得，或者分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；或者取权利要求1-6的任何一种组合物5.0～6.0g，加入丙二醇450ml、PEG400200ml及4％Na2HPO4·12H2O溶液350ml，在80℃水浴上加热搅拌至溶解，加注射用水调至总量1000ml，用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装于10ml安瓿，即得，或者分装于西林瓶中冷冻干燥，封口制成粉针剂；或者取权利要求1-6的任何一种组合物6.0～8.0g，加入用注射用水配制的3.5％乙醇溶液溶解，加3.5％乙醇溶液调至总量10000ml，用无菌滤板下衬0.22m微孔滤膜过滤，分装100ml输液，即得。
23.权利要求21或22所制备注射剂的鉴别方法，其特征在于该鉴别方法选自如下两种方法当中的一种方法一，薄层鉴别供试品的制备取所述药物组合物粉针剂，加蒸馏水溶解，取1ml或直接取注射液1ml以6mol/L盐酸溶液0.2ml酸化，待结晶析出，放置30分钟，3000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，沉淀以少量水洗至中性后加1ml丙酮溶解即得；对照品溶液的制备取银杏内酯A、B、C、K对照品适量，加丙酮溶解，制成每1mL分别含1mg、1mg、1mg、0.01mg，即得；测定法按照薄层色谱法，用微量点样器分别取上述供试品和对照品溶液各10μL点样于同一块含4％醋酸钠，用0.5％CMC-Na溶液制成的硅胶GF254薄层板上，以石油醚∶丙酮∶甲醇＝10∶2.5∶0.3为展开剂，上行展开，取出，吹干，于160℃加热30分钟，置紫外灯365nm下检视，供试品与对照品应在对应位置上显示相同颜色的斑点；方法二，取所述药物组合物粉针剂制备的溶液1滴滴于滤纸上吹干后喷洒10％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置365nm紫外灯下观察，呈黄色荧光。
24.权利要求1或13中所述银杏内酯的含量测定方法，其特征在于按照高效液相色谱法测定；色谱条件与系统适应性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以异丙醇∶甲醇∶水＝8∶24∶80为流动相，检测波长220nm，理论塔板数按银杏内酯B计应不低于7000；银杏内酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验还可以是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇∶水∶四氢呋喃＝70∶25∶10；蒸发光散射检测器，检测参数漂移管温度105摄氏度，载气为氮气，载气流速3.10升/min；理论踏板数按银杏内酯A峰计，应不低于3500；对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的银杏内酯A、B、K、白果内酯，分别加甲醇制成每1ml含0.5mg、0.5mg、0.02mg、0.5mg的溶液，即得；供试品溶液的制备精密称取本品100mg置10mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得；测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，测定，即得。
25.根据权利要求24的测定方法，其特征在于所说的银杏内酯含量测定的色谱条件与系统适用性试验是用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为甲醇∶水∶四氢呋喃＝70∶25∶10；蒸发光散射检测器，检测参数为漂移管温度105摄氏度，载气为氮气，载气流速3.10升/min；理论踏板数按银杏内酯A峰计，应不低于3500。
26.权利要求1或13中所述银杏内酯的鉴别方法，其特征在于按照权利要求12所述高效液相色谱法及条件试验，测定供试品中银杏内酯B的保留时间应与对照品一致。
27.权利要求1或13中所述银杏内酯的鉴别方法，其特征在于按照薄层色谱法取银杏内酯1mg加50％丙酮1ml溶解，另取银杏内酯A、B、C、K和白果内酯对照品各1mg分别加50％丙酮1ml溶解，照薄层色谱法，用微量点样器分别取上述供试品和对照品溶液各10μL点样于同一块含4％醋酸钠的0.5％CMC-Na溶液制成的硅胶GF254薄板上，以石油醚∶丙酮∶甲醇＝10∶2.5∶0.3为展开剂，上行展开后，取出，吹干，于160℃加热30分钟，置紫外灯365nm下检视，供试品与对照品应在对应位置上显示相同颜色的斑点。
28.权利要求1或13中所述银杏黄酮的含量测定方法，其特征在于用下述高效液相色谱法测定色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水∶磷酸52∶48∶0.1为流动相；检测波长为370nm；理论塔板数以斛皮素峰计算，应不低于6000；对照品溶液的制备精密称取4mg斛皮素、2mg山柰酚、2mg异鼠李素对照品于100ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得储备液；精密吸取储备液用甲醇或流动相稀释配成浓度分别为斛皮素2μg/ml，山柰酚1μg/ml，异鼠李素1μg/ml的对照品溶液；供试品溶液的制备精密称取银杏黄酮提取物50mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5ml于锥形瓶中，加入20ml甲醇和15ml 10％盐酸缓慢加热至回流，回流1小时，冷却，溶液转移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算，即得。
29.权利要求1或13中所含银杏黄酮的鉴别方法，其特征在于该方法包括取银杏黄酮提取物溶于5ml甲醇，取1滴滴于滤纸上吹干后喷洒10％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置365nm紫外灯下观察，呈黄色荧光。
30.根据权利要求8或12所述的药物组合物，其特征在于所说的银杏酸的含量检查方法是按照高效液相色谱法检查，供试品溶液峰面积不得大于对照品溶液峰面积；色谱条件与系统适应性实验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶水∶冰醋酸83∶17∶0.5为流动相；检测波长243nm，理论塔板数按银杏酸计应不低于7000；对照品溶液的制备精密称取银杏酸对照品25mg置50ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，精密量取该溶液5.0ml，定量转移至100mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，混匀，作为对照溶液，浓度为25μg/ml；供试品溶液的制备精密称取本品5g置索氏提取器中，以石油醚50ml回流提取8小时，回收溶媒，残渣以甲醇溶解并定容至1mL，该溶液经0.45μm微孔滤膜滤过，即得；测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液各20μL分别注入液相色谱仪，测定，即得。
全文摘要
本发明公开了一种药物组合物，由银杏黄酮和银杏内酯按照一定比例组成，还公开了该组合物制备的制剂及其制备方法、鉴别方法和有效成分含量测定方法。该组合物及其制剂可用于缺血性中风、脑梗塞的治疗，具有增加心率，增加冠脉流量，改善微循环，增加局部血流量的作用。
文档编号A61P9/00GK1520814SQ03102700
公开日2004年8月18日 申请日期2003年2月14日 优先权日2003年2月14日
发明者肖伟, 戴翔翎, 凌娅, 李明慧, 曹淑波, 廖正根, 肖 伟 申请人:江苏康缘药业股份有限公司