刺槐素‑7‑O‑葡萄糖醛酸苷的制备方法与流程

本发明涉及一种从香青兰中提取分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的方法。

背景技术：

刘金旗(贡菊化学成分的研究[J].中国中药杂志，2001，26(8)：547-548.)首次报道从贡菊植物分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的结构，该工艺采用萃取、硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、重结晶等技术联合从2.5kg贡菊中分离得到200mg的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷，操作复杂、步骤繁琐。

刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的结构式为：

杨建波(新疆一枝蒿化学成分的研究[J].中草药，2008，39(8)：1125-1127.)采用乙醇回流提取、萃取、硅胶柱、聚酰胺柱、SephadexLH-20柱、ODS柱反复柱层析分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷，工艺操作步骤繁琐。

张现涛(梓木草的化学成分[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2005，3(6)：357-358.)采用乙醇回流提取、萃取、硅胶柱、SephadexLH-20柱、ODS柱反复柱层析分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷，该二艺操作步骤繁琐。

靳鑫(穿心莲化学成分的研究，中草药，2012，43(1)：47-50)采用萃取、硅胶柱色谱等手段首次从穿心莲植物分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷，该工艺采用了6种技术联合进行分离，操作复杂、步骤繁琐。

黄松(独脚金黄酮类化学成分研究[J].中药材，2010，33(7)：1089-1091.)采用D101大孔树脂、聚酰胺柱层析和反相制备液相色谱法从1kg独角金植物中分离得到9.46mg的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷，该方法分离制备得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的量较少，仅为9.64mg·kg^-1。

目前无市售的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷纯品，其药理活性尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从香青兰中提取分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用5～10倍量的40％～75％乙醇浸泡12～24h；

b、采用渗漉法，香青兰药材与40％～75％乙醇比例1∶30～40，流速1～6mL/min，收集前15倍量的渗漉液；

c、渗漉液用孔径0.1～10mm的网孔过滤1～5次，滤液合并；

d、用减压浓缩装置，在压力：0.08～0.1Mpa，温度：30～60℃下，蒸馏除去乙醇得0.8～1.2g/mI的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉；

e、将浸膏粉采用70％～100％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，20～95％乙醇梯度洗脱，并收集40％～60％乙醇的洗脱液；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.08～0.1Mpa，温度：40～60℃下蒸干，得浸膏粉；

f、将上述所得浸膏粉用50％甲醇溶解上ODS填料，50～100％甲醇-0.5％甲酸水梯度洗脱，并收集55～60％甲醇-0.5％甲酸水的洗脱液；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.08～0.1Mpa，温度：40～60℃下蒸干得化合物I粗品。

g、为了进一步纯化所得粗品，滤去杂质，采用HPLC在流动相为55～60vol％甲醇和0.5％甲酸水溶液的条件下对粗品进行制备得制备液，洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.08～0.1Mpa，温度：40～60℃下蒸干得单体刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

有益技术效果

本专利采用聚酰胺和ODS柱色谱技术联合的方法，方法简单，步骤简短。从1kg香青兰植物中分离得到121mg的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷，转移率较高。

本发明获得的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷纯度高，达到98％。

附图说明

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的上述和其他目的、特征和优点作出进一步详细的说明。

图1为本发明提供方法的工艺流程图；

图2为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的紫外光谱(UV)图；

图3为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的红外光谱(IR)图；

图4为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的电喷雾质谱(ESI-MS)图；

图5为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的核磁共振氢谱(¹H-NMR)图；

图6为根据本发明一个实施例所制备的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的核磁共振碳谱(¹³C-NMR)图。

具体实施方式

本发明提供的一种刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的制备方法，包括获得香青兰的提取物，以及对提取物进一步层析、HPLC制备等步骤。下面结合附图，详述本发明所提供的方法。

如图1所示，首先，将1份重量的香青兰干燥的地上部分粉碎，用30～40重量倍数的40～75vol％的乙醇溶液渗漉提取。然后，将提取液浓缩，例如可以采用减压浓缩的方法，浓缩后提取液呈膏状。之后再将膏状物干燥，例如可以采用真空干燥的方法，将膏状物制成浸膏粉。

将浸膏粉进行聚酰胺柱层析。层析的步骤可以为：将浸膏粉采用高浓度醇溶解后拌入聚酰胺中，例如可以采用100～200目的层析用聚酰胺，拌入的比例为浓缩后的浸膏粉与层析用聚酰胺的重量比为1∶10～20。上柱完毕后，流动相采用乙醇溶液，按梯度20％～95％的比例通入流动相进行洗脱。合并相同组分洗脱液，浓缩，得到40％～60％乙醇洗脱馏分。

将40％～60％乙醇洗脱馏分采用70％乙醇溶解，滤除杂质，再浓缩后进行ODS柱层析，流动相采用复合洗脱剂，所述复合洗脱剂由A组分和B组分构成，所述A组分选自下述组中的至少一种：甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮或丁醇，所述B组分为水、甲酸-水、磷酸-水，所述A组分与B组分的体积比为1∶1～8∶2。例如流动相可以采用甲醇-0.5％甲酸水，甲醇-0.5％甲酸水的体积比依次为55∶45、6∶4、8∶2。此时刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的组分主要在流动相甲醇-0.5％甲酸水体积比为6∶4时被洗脱。最后，合并相同组分洗脱液并浓缩，得到化合物I的粗提物。

进一步地，为了提高刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的纯度，还可用HPLC对刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷进行制备，例如色谱柱为C₁₈(150*10mm，10μm)，流动相为50～60vol％甲醇和0.5％甲酸水溶液，流速为3.5mL/min，进样量为0.5～1.0mL，对上述粗提物进行HPLC制备，即得到淡黄色粉末状结晶，为刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷成品，其纯度可达95％以上。经UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR对所得组分的结构进行鉴定，可知其为刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

图2、图3为根据本发明的制备方法制备的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的UV图谱和IR图谱。

图4为根据本发明的制备方法制备的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的ESI-MS的分析可知，ESI-MS特征峰在m/z461[M⁺](正离子)，m/z316.20[M⁺-COOH]，m/z285.10[M⁺-Glucuronide]。再结合图5、图6所示的根据本发明的制备方法制备的田蓟苷的NMR图谱分析，可确定其分子量为460，分子式为C₂₂H₂₀O₁₁，其中，¹H-NMR(400MHz，DMSO)图谱中表现出典型的黄酮苷类化合物的氢谱特征，通过耦合常数及化学位移可确定每个氢的归属，δ：12.91(5-OH)，8.07(d，J＝8.0Hz，H-2′，6′)，7.13(d，J＝8.4Hz，H-3′，5′)，6.95(s，H-3)，6.86(d，J＝1.5Hz，H-8)，6.45(d，J＝1.5Hz，H-6)，5.12(d，J＝7.5Hz，H-1″)；¹³C-NMR(DMSO，400MHz)图谱中呈现出22个碳信号，为1个CH3，12个CH，8个季碳，δc表明分子中含一个羰基(δ182.9)，δ：163.83(C-2)，103.79(C-3)，182.06(C-4)，163.10(C-7)，162.47(C-4′)，157.76(C-9)，128.47(C-2′，6′)，122.68(C-1′)，114.66(C-3′，5′)，105.37(C-10)，99.93，99.57(C-6)，(C-1″)，94.81(C-8)，73.28(C-2″)，76.40(C-3″)，72.30(C-4″)，74.05(C-5″)，172.20(C-6″)，55.60(OCH₃)。通过归峰解谱可确定所得化合物为刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：从香青兰中提取分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的方法，按以下步骤进行：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用5倍量的40％的乙醇浸泡12h，得到提取液；

b、采用渗漉法，香青兰药材3kg与40％乙醇比例1∶30，流速1mL/min，收集前15倍量的乙醇渗漉液；

c、渗漉液用孔径0.1mm的网孔过滤1次，滤液合并；

d、用减压浓缩装置，在压力：0.08Mpa，温度：30℃下，蒸馏除去乙醇得0.8g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉250g；

e、将100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，20～95％乙醇梯度洗脱得到洗脱液共95000mL，收集50％-60％乙醇梯度的洗脱液25000mL；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：40℃下蒸干，得浸膏粉11.00g；

f、将上述所得浸膏粉1.50g用50％甲醇溶解上ODS填料，粒径大小：50μm，孔径大小：120A，55～100％甲醇-0.5％甲酸水2L梯度洗脱得到洗脱液，收集55-60％甲醇-0.5％甲酸水梯度洗脱液800mL；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：40℃下蒸干得化合物I的粗品；

g、为了进一步纯化所得粗品，滤去杂质，采用HPLC在流动相为55～60vol％甲醇和0.5％甲酸水溶液的条件下对粗品进行制备得制备液。制备液用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：40℃下蒸干得淡黄色粉末20mg。

一、结构鉴定：取所得样品分别对UV、IR、MS、NMR进行归峰解谱，确定实施例1所提纯的样品为刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

二、纯度鉴定：

熔点(mp)测定：255℃～257℃。

薄层色谱检测：采用两种展开体系进行检测，薄层板用聚酰胺薄膜。展开剂A为乙醇-甲酸水(体积比为1∶1)，R_fA为0.21；展开剂B为乙酸乙酯-95％乙醇(体积比为6∶4)，R_fB为0.38，紫外365nm下见黄色斑点，无杂质点。

HPLC检测：用HPLC外标法测定含量，选定260nm和330nm为检测波长。选用乙腈-0.1％磷酸水溶液(30∶70，V/V)为流动相，以刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。精密称取实施例1制备的淡黄色粉末2.50mg于250mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度线。经Waters分析型高效液相色谱检测，外标法定量，其纯度为98.36％。

得率计算：

刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷浓度为9.83μg·mL^-1，香青兰中刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的量为287mg/kg。

得率＝(9.83μg·mL^-1×250mL)/(2.5mg×3000g/367mg×287mg/kg)×100％＝41.90％

经检测，实施例1提取得到的刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的纯度为98.36％，得率为41.90％。

实施例2：从香青兰中提取分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的方法，按以下步骤进行：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用10倍量的75％的乙醇浸泡24h；

b、采用渗漉法，香青兰药材4kg与75％乙醇比例1∶40，流速6mL/min，收集前15倍量乙醇渗漉液；

c、渗漉液用孔径10mm的网孔过滤5次，滤液合并；

d、用减压浓缩装置，在压力：0.1Mpa，温度：60℃下，蒸馏除去乙醇得1.2g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉305g；

e、将100g浸膏粉采用70％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，30～75％乙醇80000mL梯度洗脱得到洗脱液，并收集40～60％乙醇的洗脱液32000mL；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.1Mpa，温度：60℃下蒸干，得浸膏粉13.65g；

f、将上述所得浸膏粉2g用50％甲醇溶解上ODS填料，粒径大小：50μm，孔径大小：120A，50～80％甲醇-0.5％甲酸水2500mL梯度洗脱，收集55-60％甲醇-0.5％甲酸水的洗脱液1500mL；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.1Mpa，温度：40℃下蒸干得化合物I的粗品；

g、为了进一步纯化所得粗品，滤去杂质，采用HPLC在流动相为55～60vol％甲醇和0.5％甲酸水溶液的条件下对粗品进行制备得制备液。制备液用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：40℃下蒸干得淡黄色粉末23.50mg。

一、结构鉴定：取所得样品分别对UV、IR、MS、NMR进行归峰解谱，确定实施例1所提纯的样品为刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

二、纯度鉴定：

熔点(mp)测定：255℃～257℃。

薄层色谱检测：采用两种展开体系进行检测，薄层板用聚酰胺薄膜。展开剂A为乙醇-甲酸水(体积比为1∶1)，R_fA为0.21；展开剂B为乙酸乙酯-95％乙醇(体积比为6∶4)，R_fB为0.38，紫外365nm下见黄色斑点，无杂质点。

HPLC检测：用HPLC外标法测定含量，选定260nm和330nm为检测波长。选用乙腈-0.1％磷酸水溶液(30∶70，V/V)为流动相，以刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。将实施例2制备的化合物C结晶用甲醇溶解，经Waters分析型高效液相色谱检测，外标法定量，其纯度为99.15％，得率为42.09％。

实施例3：从香青兰中提取分离得到刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷的方法，按以下步骤进行：

a、将香青兰干燥的地上部分粉碎，用7倍量的60％的乙醇浸泡18h；

b、采用渗漉法，香青兰药材2kg与60％乙醇比例1∶35，流速4mL/min，收集前15倍量乙醇渗漉液；

c、渗漉液用孔径0.5mm的网孔过滤2次，滤液合并；

d、用减压浓缩装置，在压力：0.09Mpa，温度：50℃下，蒸馏除去乙醇得1.0g/mL的稠浸膏；水浴干燥后得浸膏粉170g；

e、将浸膏粉100g采用80％乙醇溶解后干法拌样，上100～200目聚酰胺进行柱层析，30～95％乙醇80000mL梯度洗脱得到洗脱液，并收集50％-60％乙醇的洗脱液21000mL；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.1Mpa，温度：60℃下蒸干，得浸膏粉10.50g；

f、将上述所得浸膏粉1.50g用50％甲醇溶解上ODS填料，粒径大小：50μm，孔径大小：120A，55～80％甲醇-0.5％甲酸水2000mL洗脱，并收集55～80％甲醇-0.5％甲酸水的洗脱液1000mL；洗脱液用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：40℃下蒸干得化合物I的粗品；

g、为了进一步纯化所得粗品，滤去杂质，采用HPLC在流动相为55～60vol％甲醇和0.5％甲酸水溶液的条件下对粗品进行制备得制备液。制备液用减压蒸馏装置，在压力：0.08Mpa，温度：50℃下蒸干得黄色粉末20.50mg。

一、结构鉴定：取所得样品分别对UV、IR、MS、NMR进行归峰解谱，确定实施例1所提纯的样品为刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。

二、纯度鉴定：

熔点(mp)测定：255℃～257℃。

薄层色谱检测：采用两种展开体系进行检测，薄层板用聚酰胺薄膜。展开剂A为乙醇-甲酸水(体积比为1∶1)，R_fA为0.21；展开剂B为乙酸乙酯-95％乙醇(体积比为6∶4)，R_fB为0.38，紫外365nm下见黄色斑点，无杂质点。

HPLC检测：用HPLC外标法测定含量，选定260nm和330nm为检测波长。选用乙腈-0.1％磷酸水溶液(30∶70，V/V)为流动相，以刺槐素-7-O-葡萄糖醛酸苷。将实施例3制备的化合物C结晶用甲醇溶解，经Waters分析型高效液相色谱检测，外标法定量，其纯度为98.24％，得率为41.75％。