本发明属于生物与制药工程和
技术领域：
，具体地说涉及一种制备花色苷的方法。
背景技术：
：花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。花色苷属于类黄酮——它是以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。现代科学研究表明，花色苷类色素不仅是食用色素中人们最熟知的一大类天然色素，是许多国家和地区允许按需要量在果酒、果汁、饮料、糖果、冰淇淋和果酱等产品中使用的理想着色剂。花色苷还具有清除体内自由基、抗肿瘤、抗癌、抗炎、抑制脂质过氧化和血小板凝集、预防糖尿病、减肥、保护视力等生物与药理活性，对多种疾病具有预防和治疗作用。作为一种天然色素，花色苷安全、无毒（如早在1982年，联合国FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会（JECFA）就对葡萄皮花色苷提取物的毒理学安全性作了系统评估，包括急性毒性、致突变、生殖毒性和致畸毒性实验，认为其属实际无毒类。），且对人体具有多种保健功能，已被应用于食品、保健品、化妆品、医药等行业。尤其是近年来随着人们生活水平的提高和安全意识的增强，传统常用的价格低廉的化学合成色素因其固有的毒副作用和致癌的可能性引起了人们的焦虑和不安,于是，安全无毒副作用的花色苷的研究与开发引起了人们的广泛兴趣。虽然人们对花色苷的来源种类、理化特性和生理药理功能已进行了大量研究，但目前，关于花色苷的制备方法，尤其是能用于工业化生产的方法，研究的还很少，致使其生产成本高难以大规模普及应用。见于报道的制备花色苷的方法，主要还是传统的溶剂提取法、微波提取法、超声提取法和酶提取法等。溶剂提取法是最为经典的制备花色苷的方法，常用的溶剂有：盐酸、甲醇、乙醇、丙酮、硫酸、乙酸、柠檬酸等，这些溶剂中有的易燃易爆，有的剧毒，这种方法虽可以较有效的用于制备花色苷，但随着国家对环保和安全生产的重视和一系列法规的实施，所用溶剂造成的环境污染和生产安全事故的不慎发生以及由于溶剂残留对产品造成的潜在危害，它将会逐渐被淘汰；微波提取法和超声提取法也只能是溶剂提取法的辅助方法，其过程还是以溶剂为主要媒介；酶提取法虽然具有酶的高效性和专一性及作用条件的温和性等优点，但单一酶很难从植物组织中溶出花色苷，必需用复合酶才有效，其实，从本质上说，酶提取法也还是溶剂提取法的辅助方法，它并没有摆脱溶剂的参与，只是可能会有助于减少或降低溶剂的用量罢了。技术实现要素：针对上述技术方法的不足或缺陷，本发明公开了一种制备花色苷的方法——生物二次发酵微纳滤与RO复合法。本发明是这样实现的：本发明提供一种制备花色苷的方法。该方法包含以下工艺步骤：a.原料选用选用烟73、烟74、夏黑葡萄品种或其它富含花色苷的可发酵的材料，原料为无病害、无腐烂并干净无杂质；b.除梗破碎在葡萄原料除梗破碎时采用先除梗后破碎的方法以尽可能的除净果梗；c.一次发酵破碎后的葡萄果浆直接用泵打入发酵罐，然后，接种发酵，发酵温度15-32℃，发酵时间2-20天，在糖度（以葡萄糖计）小于4g/L时，或者当总糖与总酸（以酒石酸计）的差值小于2g/L，含糖量低于9g/L时，结束发酵；d.一次皮渣分离与压榨发酵结束，让清液自然流入罐外的密闭容器中同时加入一定量的护色剂，清液与皮渣分离后，将皮渣压榨，压榨出的醪液与分离出的清液混合在一起；e.二次发酵将压榨出的皮渣，称量检测，然后按质量比加入3-8倍的水和10-15%的蔗糖，搅拌溶解混合均匀后接种发酵，发酵温度25-35℃，发酵时间2-15天，在糖度（以葡萄糖计）小于4g/L时，或者当总糖与总酸（以酒石酸计）的差值小于2g/L，含糖量低于9g/L时，结束发酵；f.二次分离皮渣与压榨二次发酵结束，让清液自然流入罐外的密闭容器中同时加入一定量的护色剂，清液与皮渣分离后，将皮渣压榨，压榨出的醪液与前述分离出的清液混合在一起，弃皮渣；g.自然沉降将两次发酵结束后的全部醪液置于沉降罐中沉降7-21天后进行固液分离，收集固态沉淀物和上清液；h.差速离心将上步固液分离后的上清液采用差速离心法进行再次沉降分离，收集沉淀物；i.上清液冷处理将差速离心分离后得到的清液泵入冷冻罐，于醪液冰点以上1-5℃冷冻处理1-7天；j.管式/碟式离心将冷处理后的醪液采用管式/碟式离心技术进行固液分离以进一步收集花色苷；k.多级错流膜微滤将管式/碟式离心后清液再进行多级错流膜微滤进一步提取花色苷；此步处理后的清液或进行下一步处理或不再处理作为生产红酒或白兰地的原料；l.纳滤与反渗透（RO）将多级错流膜微滤后的清液再进行纳滤与反渗透以进一步提取花色苷；m.再次护色处理将以上各步骤制备的花色苷或收集在一起或管式/碟式离心之前与之后的分别收集，再加入或各加入一定量的护色剂，搅拌混合均匀；n.干燥将经过护色处理后的花色苷采用低温真空干燥或真空冷冻干燥；o.粉碎过筛将干燥的花色苷进行粉碎过筛以获得不同粒度的制品；p.检验将制备的花色苷进行理化及卫生等指标的检验；q.成品将检验合格的花色苷产品作为成品待用。其中，所述a.步骤中制备花色苷的原料系指烟73、烟74、夏黑葡萄品种或其它富含花色苷的材料中的任何一种或其组合，包括天然原料本身和用其酿酒加工后的无污染的副产物，副产物如皮渣等要先二次发酵后再进行花色苷的分离提取制备。所述e.步骤中的发酵用水是指低温无菌水。所述d.f.m.步骤中的护色处理中所用的护色剂为食用级以上原料，优选为Vc与甘氨酸的任何一种或其组合。所述n.干燥步骤中冷冻真空干燥是在真空度25-100Pa，温度20-40℃条件下冷冻真空干燥；或真空干燥是在真空度0.01-0.095MPa，温度45-75℃条件下的真空干燥。所述步骤o.的粉碎包括普通/万能粉碎和超微粉碎。所述步骤l.的纳滤与反渗透（RO）包括一级纳滤与反渗透和二级纳滤与反渗透。本发明所述工艺方法是一种多功能的复合方法，可根据对最终花色苷产品质量的要求，可在自然沉降、差速离心、管式/碟式离心、多级错流膜微滤和纳滤与反渗透等不同阶段单独收集样品，也可把每一阶段或某几个阶段收集的样品混合在一起进行后续处理，以得到不同档次/级别/类型的花色苷产品。本发明生物二次发酵微纳滤与RO复合法与传统制备花色苷的方法相比，具有如下特点和有益效果：（1）完全摆脱了溶剂的参与，是一种真正的无溶剂提取法，因此，也就无需担忧所用溶剂造成的环境污染和生产安全事故的发生以及由于溶剂残留对产品造成的潜在危害；（2）本发明方法中的生物二次发酵法不仅可以最大限度地溶出花色苷，而且生物催化转化技术的采用还可以合成新的花色苷和对花色苷具有辅色作用的辅色素，这一点儿是任何一种传统方法所无法比拟的；（3）本发明的制备方法条件温和，工艺流程简单合理，无溶剂使用引起的环境污染等问题，既环保又节能；（4）安全性高，本发明方法无需高温高压，不用有机或无机溶剂，从根本上消除了易燃易爆的安全隐患，当然，除了可以反复并容易利用的发酵剂——水之外，也不用考虑溶媒的回收问题；（5）适用面广，凡是能发酵的含有花色苷的生物质材料均可用本发明方法制备花色苷；（6）全过程是在一个密闭容器与管道构成的洁净系统环境中进行的，不会出现常见的跑、冒、滴、漏等不良现象，符合国家GMP的相关要求；（7）采用本发明方法制备的产品无污染，安全可食；（8）本发明所述工艺方法是一种多功能的复合方法，可根据对最终花色苷产品质量的要求，进行多类型多档次的花色苷产品的制备与开发。本发明产品的重金属和微生物等安全性指标检测结果如下表1和2：表1皮肤刺激性和重金属项目指标新国安标准多次皮肤刺激性0度1度以下汞(Hg)，mg/kg≤0.11砷(As)，mg/kg≤0.22铅（Pb），mg/kg≤1.510镉（Cd），mg/kg≤1.25二噁烷，mg/kg≤2.530甲醇，mg/L≤682000石棉无不得检出a注：本表和下表2中所述的“新国安标准”是指国家食品药品监督管理总局2015年12月发布的拟于2016年12月实施的《化妆品安全技术规范》（2015年版）（2015年第268号）。表1和2所列各项检测指标均是按《化妆品安全技术规范》（2015年版）新标准执行。表2微生物指标项目指标新国安标准菌落总数，CFU/g或CFU/mL≤381000耐热大肠菌群/g，或/mL无金黄色葡萄球菌/g，或/mL无铜绿假单胞菌/g，或/mL无霉菌和酵母菌，CFU/g或CFU/mL≤6100由表1和2可以看出，本发明面膜的重金属和微生物等安全性指标的检测结果，不仅完全符合现行的2007版的《化妆品卫生规范》，而且还按于2016年12月才执行的《化妆品安全技术规范》（2015年版）新标准进行了新加项目的检测并明显优于《化妆品安全技术规范》的要求。再参比国家2012年以后颁布的食品安全的最新相关国家标准，本发明产品的安全性也是符合相关规定的。具体实施方式下面结合实施例对本发明作详细描述：实施例l：一种制备花色苷的方法，包含以下工艺方法步骤：a.原料选用选用烟73、夏黑2种葡萄，各占1/2，原料为无病害、无腐烂并干净无杂质；b.除梗破碎在葡萄原料除梗破碎时采用先除梗后破碎的方法以尽可能的除净果梗；c.一次发酵破碎后的葡萄果浆直接用泵打入发酵罐，然后，接种发酵，发酵温度28℃，发酵时间7天，在糖度（以葡萄糖计）小于4g/L时，或者当总糖与总酸（以酒石酸计）的差值小于2g/L，含糖量低于9g/L时，结束发酵；d.一次皮渣分离与压榨发酵结束，让清液自然流入罐外的密闭容器中同时加入一定量的护色剂，清液与皮渣分离后，将皮渣压榨，压榨出的醪液与分离出的清液混合在一起；e.二次发酵将压榨出的皮渣，称量检测，然后按质量比加入5倍的水和12%的蔗糖，搅拌溶解混合均匀后接种发酵，发酵温度29℃，发酵时间5天，在糖度（以葡萄糖计）小于4g/L时，或者当总糖与总酸（以酒石酸计）的差值小于2g/L，含糖量低于9g/L时，结束发酵；f.二次分离皮渣与压榨二次发酵结束，让清液自然流入罐外的密闭容器中同时加入一定量的护色剂，清液与皮渣分离后，将皮渣压榨，压榨出的醪液与前述分离出的清液混合在一起，弃皮渣；g.自然沉降将两次发酵结束后的全部醪液置于沉降罐中沉降7-21天后进行固液分离，收集固态沉淀物和上清液；h.差速离心将上步固液分离后的上清液采用差速离心法进行再次沉降分离，收集沉淀物；i.上清液冷处理将差速离心分离后得到的清液泵入冷冻罐，于醪液冰点以上3℃冷冻处理4天；j.管式/碟式离心将冷处理后的醪液采用管式/碟式离心技术进行固液分离以进一步收集花色苷；k.多级错流膜微滤将管式/碟式离心后清液再进行多级错流膜微滤进一步提取花色苷；此步处理后的清液或进行下一步处理或不再处理作为生产红酒或白兰地的原料；l.纳滤与反渗透（RO）将多级错流膜微滤后的清液再进行纳滤与反渗透以进一步提取花色苷；m.再次护色处理将以上各步骤制备的花色苷或收集在一起或管式/碟式离心之前与之后的分别收集，再加入或各加入一定量的护色剂，搅拌混合均匀；n.干燥将经过护色处理后的花色苷采用低温真空干燥或真空冷冻干燥；o.粉碎过筛将干燥的花色苷进行粉碎过筛以获得不同粒度的制品；p.检验将制备的花色苷进行理化及卫生等指标的检验；q.成品将检验合格的花色苷产品作为成品待用。实施例2：与实施例1的步骤相同，所不同的是：（1）原料选用酿酒葡萄赤霞珠、蛇龙珠和美乐三者的组合；（2）一次发酵的发酵温度15℃，发酵时间20天；（3）二次发酵的条件为，皮渣中按质量比加入8倍的水和10%的蔗糖，搅拌溶解混合均匀后接种发酵，发酵温度25℃，发酵时间15天；（4）上清液冷处理将差速离心分离后得到的清液泵入冷冻罐，于醪液冰点以上1℃冷冻处理1天。实施例3：与实施例1的步骤相同，所不同的是：（1）原料选用蓝莓；（2）一次发酵的发酵温度32℃，发酵时间2天；（3）二次发酵的条件为，皮渣中按质量比加入3倍的水和15%的蔗糖，搅拌溶解混合均匀后接种发酵，发酵温度35℃，发酵时间2天；（4）上清液冷处理将差速离心分离后得到的清液泵入冷冻罐，于醪液冰点以上5℃冷冻处理1天。实施例4：与实施例1的步骤相同，所不同的是：（1）原料选用酿酒葡萄赤霞珠、蛇龙珠和美乐三者酿酒后的皮渣；（2）不再进行一次发酵；（3）二次发酵的条件为，皮渣中按质量比加入6倍的水和13%的蔗糖，搅拌溶解混合均匀后接种发酵，发酵温度26℃，发酵时间10天；（4）上清液冷处理将差速离心分离后得到的清液泵入冷冻罐，于醪液冰点以上3℃冷冻处理4天。实施例5：与实施例1的步骤相同，所不同的是：（1）原料选用黑米，料水比为1:8；（2）一次发酵的发酵温度30℃，发酵时间12天；（3）二次发酵的条件为，残渣中按质量比再加入5倍的水和10%的蔗糖，搅拌溶解混合均匀后接种发酵，发酵温度34℃，发酵时间4天；（4）上清液冷处理将差速离心分离后得到的清液泵入冷冻罐，于醪液冰点以上4℃冷冻处理2天。实施例6：与实施例1的步骤相同，所不同的是：（1）原料选用紫薯，用前先破碎，料水比为1:4；（2）一次发酵的发酵温度28℃，发酵时间8天；（3）二次发酵的条件为，残渣中按质量比再加入3倍的水和13%的蔗糖，搅拌溶解混合均匀后接种发酵，发酵温度34℃，发酵时间3天；（4）上清液冷处理将差速离心分离后得到的清液泵入冷冻罐，于醪液冰点以上2℃冷冻处理3天。本发明不限于上述所述的实施案例。当前第1页1 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