一种维吉尼亚链霉菌IBL14typeI‑B‑sv14型CAS基因编辑系统的制作方法

文档序号:12412101阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I-B-sv14型CAS基因编辑系统,其特征在于:该系统包含一个cas7-5-3-4-1-2六个基因所组成的重组蛋白表达质粒和一个基因编辑质粒。

2.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I-B-sv14型CAS基因编辑系统,其特征在于:编辑方法包括以下步骤:

(1)根据维吉尼亚链霉菌IBL14基因cas7-5-3-4-1-2及相关信息序列设计引物,以提取到的维吉尼亚链霉菌IBL14基因组为模版,用TransTaq DNA Polymerase High Fidelity 聚合酶通过聚合酶链式反应扩增得到末端带有与载体限制性内切酶识别和切割位点15-25 bp重叠区域的cas7-5-3-4-1-2基因,连接到质粒plasmid上,得蛋白表达质粒plasmid-cas7-5-3-4-1-2;

(2)根据靶向基因DNA序列信息设计引物,以提取到的原核生物基因组为模版,用TransTaq DNA Polymerase High Fidelity DNA聚合酶通过PCR反应分别扩增得到末端带有限制性内切酶识别和切割位点以及overlap PCR互补序列的靶向基因上下同源臂PCR片段,并用overlap PCR将上下同源臂结合起来构建基因编辑模版template DNA/t-DNA,同时根据生物靶向基因序列信息设计并直接合成首尾分别含T7启动子和RNA终止子的靶向基因片段guide-DNA/g-DNA,将基因编辑模版与靶向基因片段连接到质粒上得基因编辑质粒plasmid-t/gDNA;

(3)制备原核生物细胞感受态,并将按步骤(1)得到的蛋白表达质粒和按步骤(2)得到的各种靶向基因编辑质粒分别转化到目标菌感受态中得到不同的基因编辑后的重组子,对重组子染色体进行PCR和基因测序和/或功能分析,以确证编辑后的目的重组子。

3.根据权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I-B-sv14型CAS基因编辑系统,其特征在于:所述的基因编辑指应用该蛋白表达质粒结合基因编辑质粒和/或其它质粒可对原核细胞的染色体基因进行敲除、插入、无痕点突变及任意组合。

4.一种如权利要求1所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I-B-sv14型CAS基因编辑系统,其特征在于,其可用于原核生物基因编辑及免疫。

5.根据权利要求4所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I-B-sv14型CAS基因编辑系统,其特征在于:所述原核生物指大肠杆菌、枯草杆菌及其它各种原核微生物。

6.根据权利要求4所述的一种维吉尼亚链霉菌IBL14 type I-B-sv14型CAS基因编辑系统,其特征在于:所述的免疫指通过基因编辑模版设计的CRISPR可应用于生物细胞阻止外源核酸的侵入。

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