抗耐药性感染多肽Cbf-14-2及其用途的制作方法

本发明涉及生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及到一种多肽及其用途，即多肽具有抗耐药性细菌感染的用途。

背景技术：

自从青霉素被发现至今，抗生素类药物一直被认为在抗感染方面有着神奇的功效，显著地提高了人类的生存质量。然而，抗生素类药物的广泛使用乃至滥用，导致了多重耐药菌的出现，给临床诊治带来了巨大的挑战。

抗菌肽是机体先天免疫系统的一个关键组成部分，在自然界中普遍存在。天然存在的抗菌肽通常为较短的氨基酸序列，长度在15到40个之间。抗菌肽的表面带有正电荷，通常由天然氨基酸中精氨酸、赖氨酸以及组氨酸提供正电荷，电荷量一般为+4到+6。在亲水环境中，抗菌肽呈无规则卷曲结构，而在生物膜或模拟疏水环境下，可以形成α-螺旋，表现出显著的两亲性，即亲水基团集中在肽链的一侧，而疏水基团集中在另一侧。首先，带有正电荷的抗菌肽扩散到细菌细胞膜表面带有负电荷的区域，即脂多糖LPS、磷壁酸等酸性聚合物所在的区域。抗菌肽与细菌细胞膜通过静电作用结合后，结构由无规则卷曲转换为α-螺旋。随后，抗菌肽的亲水面与磷脂双分子层的亲水性头部集团连接，疏水面与磷脂双分子层疏水的脂肪酰基链连接，在细菌细胞膜上形成低聚膜孔。最后，细菌细胞膜形成孔状结构，胞内内容物渗出，从而导致细菌死亡。抗菌肽广谱的抗菌活性、独特的作用机制及其相对于抗生素不易产生耐药性，使其成为抗生素潜在的替代品。

Cathelicidin家族，是一类N-端含有Cathelin结构域而C-端具有高度特异性的成熟肽段的抗微生物肽家族，对革兰阴性菌、革兰阳性菌和真菌都有较好的抑杀作用。

抗菌肽Cbf-14是本实验室依据Cathelicidin家族的抗菌肽BF-30的序列经优化设计后的多肽突变体，其是由14个氨基酸组成的阳离子抗菌肽，氨基酸序列为RLLRKFFRKLKKSV，分子量1819.33.该技术记载于中国专利申请CN103435686B中(抗耐药性细菌感染多肽Cbf-14及其用途)。

技术实现要素：

本发明依据抗菌肽Cbf-14，引入非天然氨基酸，获得对耐药性细菌具有较高抑制活性的多肽Cbf-14-2。本发明抗菌多肽，氨基酸序列如SEQ ID：NO：1所示。全序列为精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-鸟氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-鸟氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸。本发明的多肽可以采用固相合成法获得。

本发明的Cbf-14-2是将Cbf-14第五位以及第九位的赖氨酸替换成与同样带一个正电荷但侧链比其少一个C原子的非天然的鸟氨酸。改造后之后的突变体所带电荷没有发生变化，但其在疏水条件下的α螺旋程度提高。

体外抗菌活性研究表明，本发明的多肽Cbf-14-2相对与母肽Cbf-14对临床的耐药菌具有更显著的杀灭作用。所述的临床耐药菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌。

体外的毒性研究表明，本发明的多肽Cbf-14-2对绵羊红细胞有低的溶血活性，对小鼠的脾细胞有低的毒性。即本发明的多肽对哺乳动物细胞的毒性极小。

体内菌血症模型的研究结果表明，多肽Cbf-14-2能够显著提升菌血症小鼠的生存率，保护菌血症小鼠的体重，降低其血液中菌浓，同时对耐药株引起的肺部组织感染炎症具有很好的治疗作用。所述的耐药株为铜绿假单胞菌。

下面是部分药效学试验及结果：

一、本发明多肽Cbf-14-2对临床耐药细菌的体外抗菌活性

(1)Cbf-14-2对细菌的最低抑菌浓度(MIC)

①菌液的制备

将实验所需的菌株从-20℃保藏的甘油管中接种至营养琼脂斜面，置于37℃培养箱中培养18h后，用接种针挑取少许接种至2ml营养肉汤培养基，置于37℃培养箱中培养8h，用MH培养基倍比稀释成10⁵CFU/ml左右的菌悬液。

②药物的配制

称取适量的Cbf-14-2溶于无菌的生理盐水，将其配制成浓度为1024μg/ml的多肽母液，经0.22μM滤膜过滤除菌后分装，保存于-20℃备用。

③最低抑菌浓度的测定(MIC)

将用MH培养基倍比稀释成10⁵CFU/ml左右的菌悬液，接种至96孔板中，每孔50μl。然后等体积加入经MH倍比稀释的Cbf-14-2原液，使药物终浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml。同时设100μl的MH培养基作为不含菌液和药物的空白对照组，设50μl菌液加入等体积的MH培养基作为只含菌液的阳性对照组。将96孔板置于37℃的恒温培养箱中培养约18h。然后，用酶标仪测定96孔板在595nm处的吸光度结果并记录，药物能够完全抑制菌液生长的最低浓度被定义为最低抑菌浓度，即MIC。结果见表1：

表1 Cbf-14-2对青霉素耐药菌株的MIC

由表1可以看出，本试验所选用的菌株对青霉素都表现出了很强的耐药性，MIC的值均大于256μg/ml，而本发明的多肽对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌耐药株的MIC值只有32μg/ml。对铜绿假单胞菌标准株作用明显，MIC值可达到4μg/ml。结果证明本发明多肽对这些耐药菌株均表现出了很好的抗菌活性。

(2)多肽Cbf-14-2对耐药细菌的最低杀菌浓度(MBC)

依次将测定MIC方法中所述，96孔板中未见细菌生长的培养物分别吸取100μl加入灭过菌的平皿中，用倾倒平板法加入恒温55℃的营养琼脂培养基，充分混匀后，在细菌培养箱中倒置培养过夜。18-24h后，观察平皿上的菌落数，平皿上的菌落数小于5个的最低药物浓度，即为最低杀菌浓度(MBC)。结果见表2：

表2 Cbf-14-2对青霉素耐药菌株的MBC

由表2可以看出青霉素在实验浓度内并没有杀死细菌，而多肽Cbf-14-2对所选实验菌株的MBC值在8-64μg/ml，说明本发明多肽对细菌有很好的杀灭作用。

(3)多肽Cbf-14-2对耐药细菌的杀菌曲线

用营养肉汤培养基将上述制备的细菌悬液重悬，调整细菌浓度为10⁵CFU/ml左右，加入4倍MIC的Cbf-14-2，置于37℃的恒温培养箱中继续培养，在0min、10min、30min、1h、2h、4h、8h时，吸取混合培养物100μl进行系列稀释，将稀释液依次加入培养皿内并加入营养琼脂培养基混匀，每个稀释度做3个平行，置于37℃的恒温培养箱中继续培养18h后，进行活菌计数，计算平均值。然后以细菌数量的对数值为纵坐标，药物作用时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见图1、图2、图3和图4。

由附图1-4可以看出，Cbf-14-2对这些临床株有很好的杀菌作用，杀菌效果迅速，4h内使得表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌下降了5个lg CFU，细菌完全被杀死。由此可见，Cbf-14-2对临床青霉素耐药的表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均有较快的杀伤作用。

二、本发明多肽Cbf-14-2对真核细胞的毒性

(1)多肽对绵羊红细胞溶血的影响

将新鲜的脱纤维绵羊血离心(3000rpm，10min)，弃上清，将沉淀在下层的红细胞用PBS洗涤3次，吸取0.3ml绵羊红细胞重悬于10ml的PBS中，制成体积分数为3％的绵羊红细胞悬液。将绵羊红细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔50μl，再向各孔中分别加入50μl经倍比稀释的多肽，各孔中多肽的终浓度分别为16,32,64,128,256,512μg/ml。阳性对照分别为终浓度1％Triton X-100和无菌去离子水，阴性对照PBS。每组设3复孔。加药后将96孔细胞培养板置于37℃培养30min，经离心，取上清液使用酶标仪测定450nm处波长。以阳性对照组为100％溶血率，阴性对照组为0％溶血率，计算多肽对绵羊红细胞的溶血率。

溶血率＝(加药组OD450-阴性对照组OD450)/(阳性对照组OD450-阴性对照组OD450)×100％

由附图5我们看出来随着多肽浓度的增加，溶血率略有增加。但在浓度为512μg/ml时，溶血率不超过5％。因此可认为本发明的多肽在药物有效作用范围内，不具有溶血性。

(2)多肽对小鼠原代脾细胞增殖的影响

选取成年ICR小鼠脱臼处死，用75％酒精浸泡5min除菌，无菌条件下解剖小鼠取其脾脏，生理盐水洗涤后，经200目筛网研磨，重悬于生理盐水，3000rpm离心5min，弃上清，加红细胞裂解液裂解5min，再次离心后，用生理盐水洗涤3次，收集脾细胞沉淀。用含10％小牛血清和双抗的RPMI-1640培养基重悬，计数调整细胞浓度为1×10⁷个/ml。将细胞悬液接种至96孔板中，每孔加入100μl，每组设3复孔。实验组每孔加入20μl用培养基稀释的不同浓度多肽，终浓度分别为20,100,200,400,800,1600μg/ml。实验设置RPMI-1640培养基对照和未给药组作为空白对照，刀豆蛋白Con A作为阳性对照。置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养48小时后，每孔加入MTT 20μl，置于37℃5％CO2细胞培养箱中继续培养4h，离心并弃掉细胞培养液上清，在96孔板每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡使甲瓒完全溶解，于490nm波长处用酶标仪测吸光值，计算细胞存活率。结果见附图6。

由附图6可以看出，随着多肽浓度从50μg/ml增加到800μg/ml，Cbf-14突变体对小鼠原代脾细胞的毒性逐渐升高。当多肽浓度达到最高浓度800μg/ml时，Cbf-14-2对脾细胞的存活率为81.28％。因此Cbf-14-2在低于800μg/ml时对小鼠原代脾细胞几乎无毒。

三、本发明多肽Cbf-14-2对菌血症模型小鼠的保护作用

取体重为18-22g的ICR小鼠随机分成6组，每组13只，雌雄各半，用0.5％CMC-Na将细菌原液制成菌浓为MLD的细菌悬液。组别设置为Cbf-14-2高剂量治疗组(10mg/kg)、Cbf-14-2中剂量治疗组(5mg/kg)、Cbf-14-2低剂量治疗组(2.5mg/kg)、多粘菌素治疗组(2.5mg/kg)、模型组、空白组。除空白组外，其他5组均腹腔注射0.5ml菌浓为MLD的菌液进行感染。Cbf-14-2治疗组在感染后0.5h和2h分别腹腔给药0.5ml，多粘菌素治疗组在感染后2h尾静脉给药0.2ml。感染12h后，每组各取3只小鼠称重，颈椎脱臼处死，解剖，取肺组织，用无菌的生理盐水洗净吸水后称量肺的重量，再加入1ml生理盐水，匀浆。用复染法对肺组织匀浆进行革兰染色，在光学显微镜下观察肺组织感染情况并拍照。

小鼠感染后，连续7天观察并记录每组小鼠的存活率以及体重变化并计算死亡保护率。

结果见附图7到图10.

由附图7可以看出，多肽对小鼠的死亡率有一定的保护作用。多肽高剂量组对小鼠死亡保护率达到70％，多肽中剂量组对小鼠死亡保护率达60％。而模型组和多肽低剂量组，小鼠的存活率分别为0％和20％。多粘菌素组、多肽高剂量组、中剂量组，与模型组相比有显著性差异。由此可见，多肽Cbf-14-2对细菌感染的小鼠的存活率具有有效的保护作用，并且体内药效呈剂量依赖关系。

由附图8可以看出，多肽对感染小鼠的体重也有很明显的保护作用，并且体内药效呈剂量依赖关系。

由附图9可以看出，多肽Cbf-14-2用药组对肺指数有一定的影响。模型组小鼠感染后肺指数由0.79％增涨至1.07％，多肽Cbf-14-2高、中、低剂量组治疗后的小鼠肺指数分别为0.95％、0.88％、0.75％，阳性对照组0.83％。多肽Cbf-14-2对治疗铜绿假单胞菌耐药株引起的肺部组织感染炎症具有治疗作用，且有剂量依赖关系，而且高剂量组(Cbf-14-210mg/kg)治疗作用优于阳性对照组。

由附图10可以看出，多肽Cbf-14-2对肺组织匀浆中细菌数有明显的影响。空白对照组中无可见细菌，模型组和多肽Cbf-14-2低剂量组中短杆状细菌分布密集，随着多肽剂量的升高，中剂量和高剂量肺组织匀浆中细菌含量明显减少。说明多肽Cbf-14-2对于细菌引起的肺部感染具有剂量依赖性的治疗作用，能够显著抑制细菌在肺部的生长和增殖。

附图说明

图1是Cbf-14-2对青霉素耐药的表皮葡萄球菌的杀菌曲线

图2是Cbf-14-2对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌的杀菌曲线

图3是Cbf-14-2对青霉素耐药的大肠埃希菌的杀菌曲线

图4是Cbf-14-2对青霉素耐药的铜绿假单胞菌的杀菌曲线

图5是Cbf-14-2对绵羊红细胞的溶血活性

图6是Cbf-14-2对小鼠脾细胞的毒性

图7是Cbf-14-2对菌血症小鼠的生存率保护

图8是Cbf-14-2对菌血症小鼠的体重保护

图9是Cbf-14-2对菌血症小鼠肺指数的影响评估

图10是Cbf-14-2对菌血症小鼠肺组织细菌数的影响

图11是本发明抗菌肽Cbf-14-2的HPLC图谱

图12是Cbf-14-2的Mass图谱

具体实施方式

实施例1

多肽Cbf-14-2的制备

按常规固相合成方法人工合成本发明多肽，制备的Cbf-14-2的多肽序列为：

精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-鸟氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-鸟氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸

多肽的合成：多肽的合成从C端到N端逐个进行。将Fmoc-Val-Wang Resin用二氯甲烷浸泡15min，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷；加入体积比为1:4的六氢吡啶/DMF溶液，使用氮气鼓动，反应2次，时间为5min和15min，反应结束后用DMF洗涤树脂9次。取少量树脂加入验色剂ABC各2-3滴(A液：茚三酮/无水乙醇溶液；B液：吡啶；C液：苯酚/无水乙醇溶液)在100℃下共热3min，溶液及树脂颜色变为蓝色，以脱除氨基保护。加入Fmoc-Val-OH和HOBT，用适量DMF溶解，加入DIC和Collidine，氮气鼓动，反应1h，反应结束后用DMF洗涤树脂6次，重复进行缩合反应，依次连接各Fmoc保护氨基酸，完成直链序列的合成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。加入TFA，在恒温摇床中反应2h，摇床转速110r/min，温度25℃。滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，用离心机离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得Cbf-14-2粗品多肽。

纯化：称取一定量粗品，加入适量乙腈，超声至澄清用过滤器除去大颗粒杂质。同时过制备型液相色谱仪，分段收取样品。用分析色谱仪做梯度分析，将达到所需纯度样品进行保留。然后进行冷冻干燥处理。

抗菌肽Cbf-14-2的HPLC纯度测定以及质谱结果：

多肽合成后经纯化得到成品，成品经过高效液相色谱、质谱进行鉴定。

液相色谱分析条件：C18色谱柱4.6×250mm,5μm；流动相A为含0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液，流动相B为含0.1％的三氟乙酸的纯净水。检测波长为220nm；体积流量为1.0ml/min；进样量20μl，进行梯度洗脱。梯度洗脱条件见表3。

表3 梯度洗脱条件

由图11可以看出，本发明多肽的纯度大于98％。

由图12可以确定其分子量为1790.20，与理论值1790.32相吻合。

序列表

<110> 中国药科大学；南京映海月生物科技有限公司

<120> 抗耐药性感染多肽Cbf-14-2及其用途

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa=Orn

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(9)

<223> Xaa=Orn

<400> 1

Arg Leu Leu Arg Xaa Phe Phe Arg Xaa Leu Lys Lys Ser Val

1 5 10