高效发酵生产细菌素的发酵装置及方法与流程

本发明涉及一种细菌素发酵及纯化分离工艺，具体的说，涉及生产细菌素的发酵分离耦合工艺。

背景技术：

细菌素，一类由微生物产生的具有抗菌作用的蛋白或多肽,能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。由于细菌素具有不污染环境、不会使致病菌产生耐药性、增强宿主免疫力等优点,在水产、食品、医药、生物农药等行业得到广泛的应用。如乳酸链球菌素(英文名Nisin)又称乳酸链球菌肽或乳链菌肽，是一种小分子多肽。分子式为C₁₄₃H₂₂₈N₄₂O₃₇S₇，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500Da。被认为是一种高效、天然生物性食品防腐剂和抗菌剂。国际上第一个被批准使用的生物防腐剂，目前已在全世界约60多个国家和地区广泛使用，主要包括乳制品(鲜牛奶、奶粉、酸奶、干酪)、罐头食品、肉制品饮料等领域。国际市场发展迅速，近年来乳酸链球菌素需求量持续增加。当前的产能和生产水平逐渐无法满足市场需求，急需在发酵工艺、提取工艺、质量管理、应用研究等方面不断提高技术水平。

根据近几年生产经验和相关文献报道[S IMSEK O,Biot echnol.Lett,2009,31(3):514-421],微生物发酵生产nisin过程中,nisin对细胞生长特别是产物合成具有显著的抑制作用,从而限制了nisin产率的提高。因此解除这些抑制将大幅度提高nisin效价,降低生产成本,这就是发酵分离耦合技术。Pongtharang ku T等人[PONGTHARANGKU T，Appl.M icrobiol.Biot echnol.,2007,74:555-562]研究了微生物发酵与膜分离和吸附分离耦合生产nisin工艺,结果表明与非耦合工艺相比,耦合工艺使nisin效价从1897IU/mL提高到7445IU/mL,效果非常显著,但是工艺复杂,分离成本较高,难以实现工业化生产。Nisin提取方法中有一种泡沫分离法，该法是先向发酵液中加入0.1％Tween-80，然后从发酵液底部鼓气使产生大量的气泡，Nisin本身具有表面活性剂的性质，因而伴随泡沫被鼓出，收集并破碎泡沫后，成功收集到Nisin，但该方法是发酵与纯化分离工艺分开进行的，并不能对Nisin产量产生积极影响。

技术实现要素：

本发明的技术目的在于提供一种高效发酵生产细菌素的发酵装置及方法，以克服现有技术存在的缺陷。

本发明所述的高效发酵生产细菌素的发酵装置，包括发酵罐、泡液分离装置和泡沫回收装置；

所述的泡液分离装置设置在所述的发酵罐内，所述的泡沫回收装置的入口通过管线与所述的发酵罐顶部的泡沫出口相连接，所述的泡沫回收装置的真空口与真空发生装置相连通；

气体入口设置在发酵罐的底部；

采用上述的装置，发酵生产细菌素的方法，包括如下步骤：

(1)将配置好的培养基，装入发酵罐，装填高度为泡液分离装置的下方，优选的，泡液分离装置的高于发酵液液面上方1～5cm；

所述培养基，含有重量浓度为0.1％～0.5％的鼓泡催化剂；

所述的鼓泡催化剂为聚氧乙烯(25EO)羊毛醇醚(Solulan 25)、聚氧乙烯月桂醚(Brij35)或聚氧乙烯单硬脂酸酯(Myrj52)；

优选的，所述的培养基，以水为载体，每1L培养基中，包括如下重量份数的组分：

所述的鼓泡催化剂，起鼓泡催化作用，帮助目的产物细菌素更加容易被气体鼓出，至发酵液上方泡沫中；

(2)在收集罐中倒入重量浓度为1～10％的消泡剂；优选的，还包括将收集罐和发酵罐进行灭菌的步骤，所述的灭菌的步骤为常规的，如蒸汽湿热灭菌方法；

(3)将发酵生产细菌素的菌种接种到发酵罐中，接种量为发酵罐中培养基装量的4％～8％，通气，进行发酵；

搅拌速度为200rpm～450rpm；

以发酵液为基准，每小时通气量为：30～180m³/发酵液体积m³。

发酵培养时间为15～48h；

发酵温度为30～35℃。

所述通气的气体种类是空气、氮气、二氧化碳或者混合气体，优选混合气体，其优选比例为：

二氧化碳：氧气：氮气比例为1:1:8的混合气体，体积比；

所述的发酵生产细菌素的菌种为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；

所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)为公知的，如食品与发酵工业，卷26(5)：19-21文献或者是CN102093962B专利公开的菌种；

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为公知的，如工业微生物，2008，(38)4:14-18文献或者是CN104480047B专利公开的菌种；

(4)启动真空发生装置，将发酵罐上部的泡沫收集到收集罐中，泡沫在消泡剂的作用下分解为液体；

(5)然后从收集罐中的液体中，收集所述的发酵产物；

优选的，还包括如下步骤：

启动循环泵，将发酵罐1中的发酵液通过循环泵送入射流管602，气体通入外管，在所述的外管的端部，喷射而出的发酵液，与气体混合后，再次进入发酵罐，进行发酵；

每小时，发酵液的循环量为发酵液总重量的25～35％；

每小时通入的气体的量为：30～180m³/循环的发酵液m³；

采用上述的方法，能够达到提高气体与发酵液的接触，提高发酵效率。

本发明的发酵罐，在工作过程中，叶斜平板上桨203随着搅拌轴旋转，将发酵过程中产生的泡沫与发酵液有效分离，并在叶斜平板上桨203的斜向上推力推动下，将泡沫不断往上方堆积。大多数细菌素具有表面活性剂性质，在鼓气和搅拌条件下产生大量泡沫，且大部分细菌素溶解在泡沫中，发酵过程中及时分离泡沫就可以有效收集目标产物且能非常有效地解除产物对细菌生产和代谢的反馈抑制作用，从而实现高效表达目标产物。

本发明的发酵装置不需要对现有普通发酵罐进行大的改动，具有极大的可操作性，提高了其实际应用效益，不用额外定制发酵罐，成本低，操作简单。泡液分离装置和泡沫回收装置可以与发酵罐一起灭菌，可以一起离线灭菌也可以一起在位灭菌，使用非常方便，成解除了产物对细菌生产和代谢的反馈抑制作用，实现目标产物最终高效表达。在发酵过程中实现目标产物的分离和收集，直接替代或者简化了下游纯化工艺。

本发明的发酵装置和培养方法，可以应用于所有具有表明活性剂性质的细菌素、抗菌肽或者抗菌蛋白等发酵生产。

附图说明

图1为高效发酵生产细菌素的发酵装置结构示意图。

图2为射流装置结构示意图。

具体实施方式

参见图1和图2，本发明所述的高效发酵生产细菌素的装置，包括发酵罐1、泡液分离装置2和泡沫回收装置3；

所述的泡液分离装置2设置在所述的发酵罐1内，所述的泡沫回收装置3的入口301通过管线与所述的发酵罐1顶部的泡沫出口102相连接，所述的泡沫回收装置的真空口303与真空发生装置连通；

气体入口101设置在发酵罐1的底部；

优选的，所述的泡液分离装置2包括：搅拌轴201、叶斜平板下桨202和叶斜平板上桨203；

所述的搅拌轴201的一端穿过所述的发酵罐1顶部，与电机相连接，另一端向下延伸至发酵罐1的底部，所述的叶斜平板上桨203设置在所述的搅拌轴201的上部，所述的叶斜平板下桨202设置在所述的搅拌轴201的下部；

优选的，所述的叶斜平板上桨203叶片宽0.5-15cm，桨叶上缘与所述的搅拌轴之间设有斜度倾角，夹角α为10°～65°；叶斜平板上桨203的数量为2～6片；

优选的，所述的所述的叶斜平板下桨203的叶片宽为0.5～15cm；

所述的泡沫回收装置3包括：收集罐304和与其相通过管线连接的泡沫吸入机构302；

所述的泡沫吸入机构302为倒置的喇叭口，所述的喇叭口设置在发酵罐内，位于泡液分离装置2的上方，所述喇叭口的顶部通过管线与发酵罐外部的收集罐301的入口相连接，收集罐的真空口通过管线与真空发生装置相连通；

优选的，所述的高效发酵生产细菌素的发酵装置，还包括发酵液循环装置，所述的发酵液循环装置包括：

循环泵5和与其相连接射流装置6，所述的循环泵5通过管线与发酵罐1底部的发酵液循环出口105相连接，所述的射流装置6包括：外管601和射流管602，所述的外管601设有循环气体入口603，所述的射流管602插在所述的外管601中，所述的射流管602的端部与外管601的流体出口604之间设有间距L，优选的，所述的间距L的长度为5～20mm；

所述的流体出口604通过管线与发酵罐1上部的循环液入口107相连接，所述的循环液入口107设置在叶斜平板上桨203叶与泡沫吸入机构302之间；

采用上述的装置，发酵生产细菌素的方法，包括如下步骤：

(1)将配置好的培养基，装入发酵罐，装填高度为泡液分离装置的下方，优选的，泡液分离装置的高于发酵液液面上方1～5cm；

所述培养基，含有重量浓度为0.1％～0.5％的鼓泡催化剂；

所述的鼓泡催化剂为聚氧乙烯(25EO)羊毛醇醚(Solulan 25)、聚氧乙烯月桂醚(Brij35)或聚氧乙烯单硬脂酸酯(Myrj52)；

优选的，所述的培养基，以水为载体，每1L培养基中，包括如下重量的组分：

所述的鼓泡催化剂，起鼓泡催化作用，帮助目的产物细菌素更加容易被气体鼓出，至发酵液上方泡沫中；

(2)在收集罐中倒入重量浓度为1～10％的消泡剂；优选的，还包括将收集罐和发酵罐进行灭菌的步骤，所述的灭菌的步骤为常规的，如蒸汽湿热灭菌方法；

所述的消泡剂选自聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚、聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚、聚氧丙烯甘油醚或聚氧丙烯；

(3)将发酵生产细菌素的菌种接种到发酵罐1中，接种量为发酵罐1中培养基装量的4％～8％，通气，加入碱性物质，如氢氧化钠，调节pH至6～7，进行发酵；

搅拌速度为200rpm～450rpm；

以发酵液为基准，每小时通气量为：30～180m³/发酵液体积m³。

发酵培养时间为15～48h；

发酵温度为30～35℃。

所述通气的气体种类是空气、氮气、二氧化碳或者混合气体，优选混合气体，其优选比例为：

二氧化碳：氧气：氮气比例为1:1:8的混合气体，体积比；

(4)启动真空发生装置，将发酵罐上部的泡沫收集到收集罐中，泡沫在消泡剂的作用下分解为液体；

(5)然后从收集罐中的液体中，收集所述的发酵产物；

优选的，还包括如下步骤：

启动循环泵，将发酵罐1中的发酵液通过循环泵送入射流管602，气体通入外管，在所述的外管的端部，喷射而出的发酵液，与气体混合后，再次进入发酵罐，进行发酵；

每小时，发酵液的循环量为发酵液总重量的25～35％；

每小时通入的气体的量为：30～180m³/循环的发酵液m³。

下面结合具体的实施例对本发明内容做进一步说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。

实施例1

采用图1和图2的装置。其中，发酵液循环装置不使用。

泡液分离装置，包括在搅拌轴上端装有一个2叶的斜叶轮，叶面宽0.5cm，斜度倾角α10°，本实施例以食品与发酵工业，卷26(5)：19-21文献报道的乳酸乳球菌发酵生产乳酸链球菌素为例，培养基为：以水为载体，每1L培养基中，包括如下重量份数的组分：

按照上述比例，配制培养基3L，装于5L发酵罐1中，调节发酵液液面高度，处于泡液分离装置下方1cm处。

收集罐中倒入重量浓度1％的消泡剂聚氧丙烯氧化乙烯甘油醚，与发酵罐一起置于50L高压湿热灭菌锅，121℃灭菌30min；

然后，将发酵罐和收集罐冷却至室温，8％接种量接种，在搅拌200rpm，每小时通气量为：30m³/发酵液体积m³，通气种类为空气，温度30℃，加入重量浓度为20％的氢氧化钠溶液调节pH6.8，发酵培养的总时间为15小时；

发酵至6h时，泡沫逐渐在泡液分离器作用下，堆积到发酵罐内部的喇叭型吸收装置处，停止向发酵罐供气，并开始对收集罐抽真空，在压差下，将发酵罐上部的泡沫快速收集到收集罐中，泡沫在消泡剂的作用下分解为液体；

发酵过程每2h取样测定OD₆₀₀，按照琼脂扩散法测定乳酸链球菌素效价。结果见表1，由结果可知，采用本发明发酵装置及方法，可以有效提高乳酸链球菌素的产量，与普通发酵工艺相比，乳酸链球菌素效价提高35.5％。

表1乳酸链球菌素发酵结果比较

表2乳酸链球菌素分离收集结果分析

由表2结果可知，60％的表达产物溶于产生的泡沫中，并在发酵的过程中被收集到收集罐，这几乎代替了纯化工艺，为后续进一步纯化缩减了步骤。

实施例2

采用图1和图2的装置。

以食品与发酵工业，卷26(5)：19-21文献记载的乳酸乳球菌发酵生产乳酸链球菌素为例。

与实施例1不同的是，发酵罐为50L的不锈钢在位灭菌发酵罐，泡液分离装置的斜叶轮为3叶，叶面宽10cm，斜度倾角25°，调整高度至发酵液面上方3cm处。

以水为载体，按照每L含聚氧乙烯月桂醚(Brij35)5g，K₂HPO₄ 10g，乙酸钠8g，MgSO₄7H₂0 2g，柠檬酸氨8g，蔗糖100g，蛋白胨10g，酵母粉10g，吐温-80 3mL的比例配置好培养基35L，装于50L玻璃发酵罐，泡液分离装置的高度至发酵液液面上方3cm处。

并于收集罐中倒入10％体积的消泡剂聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚，密封连接所有连接部位后与发酵罐一起在位121℃灭菌30min。

自然冷却至室温，8％接种量接种，设定搅拌450rpm、每小时通气量为：180m³/发酵液体积m³、通气种类为二氧化碳：氧气：氮气比例为1:1:8的混合气体，温度30℃，20％氢氧化钠调节pH6.8，开始发酵，发酵培养的总时间为48小时；

启动循环泵，每小时，发酵液的循环量为发酵液总重量的30％；

每小时通入的气体的量为：30m³/循环的发酵液m³。

发酵至6h时，泡沫逐渐在泡液分离器作用下堆积到发酵罐内部的喇叭型吸收装置处，停止向发酵罐供气，并开始对收集罐抽真空，在压差下，将发酵罐上部的泡沫快速收集到收集罐中，泡沫在消泡剂的作用下分解为液体。

发酵至24h时停止培养。发酵过程每2h取样测定OD₆₀₀，按照琼脂扩散法测定乳酸链球菌素效价。

结果见表3，由结果可知，采用本发明发酵装置及方法，可以有效提高乳酸链球菌素的产量，与普通发酵工艺相比，乳酸链球菌素效价提高52.1％。

表3乳酸链球菌素发酵结果比较

表4乳酸链球菌素分离收集结果分析

由表4结果可知，在发酵生产的同时，目标产物50％被收集到收集罐，为整个生产工艺带来了显著效益。

实施例3

采用与实施例1相同的方法。

以食品与发酵工业，卷26(5)：19-21文献记载的乳酸乳球菌，发酵生产乳酸链球菌素为例，与实施例1不同的是，发酵罐为500L的不锈钢在位灭菌发酵罐，泡液分离装置的斜叶轮为6叶，叶面宽15cm，斜度倾角65°，调整高度至发酵液面上方5cm处，其他构造与实施例1相同，其操作步骤为：

以水为载体，按照每L含聚氧乙烯单硬脂酸酯(Myrj52)3g，K₂HPO₄ 5g，乙酸钠4g，MgSO₄ 7H₂0 1g，柠檬酸氨4g，蔗糖40g，蛋白胨8g，酵母粉8g，吐温-80 2mL比例配置好培养基350L，装于500L发酵罐，泡液分离装置的高度至发酵液液面上方5cm处，

安装好泡沫回收装置，并于收集罐中倒入10％体积的消泡剂聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚，密封连接所有连接部位后与发酵罐一起在位121℃灭菌35min。

灭菌结束后，冷却至室温，8％接种量接种，设定搅拌300rpm、每小时通气量为：60m³/发酵液体积m³，通气种类为二氧化碳：氧气：氮气比例为1:1:8的混合气体，温度30℃，20％氢氧化钠调节pH6.8。

发酵至6h时，泡沫逐渐在泡液分离器作用下堆积到发酵罐内部的喇叭型吸收装置处，开始对收集罐抽真空，在压差下，将发酵罐上部的泡沫快速收集到收集罐中，泡沫在消泡剂的作用下分解为液体。发酵至24h时停止培养。发酵过程每2h取样测定OD₆₀₀，按照琼脂扩散法测定乳酸链球菌素效价。

结果见表5，由结果可知，采用本发明发酵装置及方法，可以有效提高乳酸链球菌素的产量，与普通发酵工艺相比，乳酸链球菌素效价提高68.8％。

表5乳酸链球菌素发酵结果比较

表6乳酸链球菌素分离收集结果分析

由表6结果可知，在发酵生产的同时，目标产物61％被收集到收集罐，为整个生产工艺带来了显著效益。

实施例4

采用与实施例2相同的方法，本实施例以工业微生物，2008，(38)4:14-18文献记载的枯草芽孢杆菌发酵生产枯草菌素(Subtilin)为例，发酵生产枯草菌素的方法，发酵装置构造与实施例2相同。

其中：每小时，发酵液的循环量为发酵液总重量的35％；

每小时通入的气体的量为：180m³/循环的发酵液m³。

结果见表7，由结果可知，采用本发明发酵装置及方法，可以有效提高Subtilin的产量，与普通发酵工艺相比，Subtilin效价提高38.5％。

表7 Subtilin发酵结果比较

表8 Subtilin分离收集结果分析

由表8结果可知，在发酵生产的同时，目标产物75％被收集到收集罐，为整个生产工艺带来了显著效益。

实施例5

采用与实施例3相同的方法。与实施例3不同的是，本实施例以工业微生物，2008，(38)4:14-18文献记载的枯草芽孢杆菌发酵生产枯草菌素(Subtilin)为例。

结果见表9，由结果可知，采用本发明发酵装置及方法，可以有效提高枯草菌素的产量，与普通发酵工艺相比，枯草菌素效价提高54.2％。

表9 Subtilin发酵结果比较

表10 Subtilin分离收集结果分析

由表10结果可知，在发酵生产的同时，目标产物70％被收集到收集罐，为整个生产工艺带来了显著效益。