检测辣椒叶脉黄化病毒的引物组合物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及农业科学技术领域，尤其涉及一种用于检测辣椒叶脉黄化病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。

背景技术：

辣椒叶脉黄化病毒(PeVYV)是黄症病毒科(Luteoviridae)，马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的新成员，侵染辣椒导致辣椒叶脉黄化、叶卷曲，影响辣椒正常生长，该病毒也可侵染多科植物，包括茄科，对烟草也具有潜在威胁。于1995年被日本学者正式命名为Pepper Vein Yellows Virus。目前，PeVYV在欧洲的西班牙、荷兰以及亚洲的印度、印度尼西亚、菲律宾、泰国、日本和中国台湾以及非洲的马里、苏丹等地区已经被发现并有相关报道。2015年，在我国山东和湖南有了PeVYV的报道。贵州省植物保护研究所在贵州辣椒上检测到该病毒危害，但该病毒在我国的发生、分布及危害，目前尚未见相关的报道，因此，建立该病毒的快速检测技术体系，为监测该病毒的发生、分布及危害，提供技术手段，为科学评估该病毒对农业生产的危害提供科学依据。

目前报道的PeVYV的检测方法仅有RT-PCR，该方法都需要具有较好技术背景的操作人员、以及昂贵的仪器如PCR仪和凝胶成像系统等，同时检测过程需要超过2小时的扩增过程，以及繁琐的电泳紫外观察过程。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于检测辣椒叶脉黄化病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用，该应用方法可应用于辣椒叶脉黄化病毒的快速诊断和鉴别，灵敏度高、特异性强，检测方法方便快捷。

本发明是这样实现的：本发明首先提出了这样一种用于检测辣椒叶脉黄化病毒的引物组合物，该引物组合物包括外引物和内引物以及环引物；

其中，外引物包括外引物F3和外引物B3，外引物F3的DNA序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列，外引物B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列；内引物包括内引物FIP和内引物BIP，内引物FIP的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的DNA序列，内引物BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的DNA序列；环引物包括环引物LF和环引物LB，环引物LF的DNA序列为SEQ ID NO.5所示的DNA序列，环引物LB的DNA序列为SEQ ID NO.6所示的DNA序列。

其中，外引物F3的浓度为5μM～10μM；进一步优选为10μM。所述外引物B3的浓度为5μM～10μM；进一步优选为10μM。内引物FIP的浓度为20μM～40μM；进一步优选为40μM。所述内引物BIP的浓度为20μM～40μM；进一步优选为40μM。环引物LF的浓度为20μM～40μM；进一步优选为20μM。所述环引物LB的浓度为20μM～40μM；进一步优选为20μM。具体的，将PeVYV-F3、PeVYV-B3引物稀释成10μM/L，PeVYV-FIP、PeVYV-BIP稀释成40μM/L，PeVYV-LF、PeVYV-LB稀释成20μM/L。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述引物组合物作为LAMP检测引物检测辣椒叶脉黄化病毒中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种试剂盒，优选的，所述试剂盒包括上述引物组合物，还包括DNA聚合酶。进一步优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

上述的试剂盒，优选的，所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、外引物BIP、环引物LF、环引物LB、DNA聚合酶、cDNA的体积比为：0.5∶0.5∶1∶1∶1∶1∶1∶2。

上述的试剂盒，优选的，所述检测试剂盒还包括RM反应缓冲液和DEPC水。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的检测试剂盒在检测辣椒叶脉黄化病毒中应用。

上述的检测试剂盒，优选的，所述应用方法为：

(1)提取待测样品的总RNA，并反转录为cDNA；以cDNA为模板进行PCR扩增反应，纯化PCR产物，连接转化，挑单菌落，接种到4mL液体LB培养基中(含Amp100μg/mL)，放置摇床中37℃200rpm过夜。次日用过夜培养的菌液提取质粒。

(2)以步骤(1)中的质粒为模板，采用所述的检测试剂盒进行LAMP反应得到扩增产物；

(3)将所述步骤(2)中得到的扩增产物使用Loopamp朗报荧光目视检测试剂盒(主要成分为钙黄绿素)，如果反应后的样品颜色变成绿色，则证明待测样品中含有辣椒叶脉黄化病毒；如果反应后样品的颜色为橙红色，则证明待测样品中不含辣椒叶脉黄化病毒。

上述的应用，优选的，所述步骤(2)中所述LAMP反应于62℃的水浴锅中60min，然后在80℃恒温5min或在95℃恒温2min，使酶灭活以终止反应。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)根据辣椒叶脉黄化病毒的核苷酸序列，选择该序列中相对保守且特异区域1197～2056bp序列(B1197F、B2056R引物扩增片段)作为靶序列，通过在线引物设计软件primerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物。

(2)本发明提供了一种可用于检测辣椒叶脉黄化病毒的检测试剂盒，可快速检测辣椒叶脉黄化病毒，灵敏度高、特异性强，检测方法方便快捷。

(3)本发明提供了一种采用检测试剂盒检测辣椒叶脉黄化病毒的应用方法。即采用环介导等恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplication，LAMP)进行检测，检测方法快速简便，灵敏度高。LAMP技术是近年来开发的一种新型的DNA扩增技术，该方法不需要如qRT-PCR的复杂操作和昂贵的实时定量PCR仪器，也不需要如RT-PCR长时间的扩增过程以及繁琐的电泳紫外观察过程。LAMP方法从开始检测到得出结果的全过程仅需1h，并且灵敏度高于传统的检测方法；更重要的是，可用目测比色直接判断反应结果。LAMP技术在恒温下即可直接进行基因扩增反应，不需要长时间的温度循环；且扩增反应效率高、特异性强。

附图说明

图1为LAMP常规体系试验图：1号管中为2μL 10^-1浓度(50ng/μL)的质粒为模板；2号管中为2μL ddH₂O为模板，作为空白对照；3和4号管分别为试剂盒提供的阳性和阴性对照。

图2中A图为LAMP体系反应图，B图为常规PCR反应图：1-9为10^-1～10^-9的质粒浓度；10为空白对照。

图3不同反应温度条件下进行LAMP反应扩增颜色的变化的结果图：1号：60℃；2号：62℃；3号：64℃；4号：66℃。

图4为不同反应时间条件下LAMP反应扩增颜色的变化的结果图：1号：30min；2号：45min；3号：60min；4号：75min。

图5为LAMP特异性试验图：1-6分别是A1、A2、A3、A4、A5、A6，7-阳性对照，8-阴性对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

根据辣椒叶脉黄化病毒的核苷酸序列，选择该序列中相对保守且特异区域1197～2056bp序列(B1197F、B2056R引物扩增片段)作为靶序列，通过在线引物设计软件primerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物，通过比对引物相应的3’端或5’端稳定性及引物二聚体等参数，最终选取一组最合适的引物，具体为外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF、环引物LB。

其中，外引物F3的DNA序列为SEQ ID NO.1所示的DNA序列，具体为：CACACGGCGAGGAAATCG。

外引物B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列，具体为：ACGAAGCGTATGTTGACCAT。

内引物FIP的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的DNA序列，具体为：TTGCTCGACCTTCCTCCAACTC-AGACGACGAAATGGAGGCA。

内引物BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的DNA序列，具体为：TCAGGATCTGTCACCTTCGGGC-AGGCTTTGAGAACTCCACCT。

环引物LF的DNA序列为SEQ ID NO.5所示的DNA序列，具体为：TCTCGGCTTCTTCGGTTCC。

环引物LB的DNA序列为SEQ ID NO.5所示的DNA序列，具体为：TCAGAGAGCGTCGCGCTTTC。

实施例2：

一种检测试剂盒，包括：

外引物F3(浓度10μM)：0.5μl；

外引物B3(浓度10μM)：0.5μl；

内引物FIP(浓度40μM)：1μl；

内引物BIP(浓度40μM)：1μl；

环引物LF(浓度20μM)：1μl；

环引物LB(浓度20μM)：1μl；

2×RM反应缓冲液：12.5μl；

Bst DNA聚合酶：1μl；

补充DEPC水至：25μl。

一种本实施例中检测试剂盒的应用方法，具体包括以下步骤：

(1)提取植株总RNA：

从贵州采集的病株，运用RT-PCR筛选出的辣椒叶脉黄化病毒样品，参照TRIzol-A⁺Reagents(TIANGEN)使用说明，提取辣椒叶脉黄化样品中的总RNA，参照II1^ststrand cDNA synthesis Kit(Vazyme)使用说明，使用Random hexamers将总RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增反应，纯化PCR产物，连接转化，挑单菌落，接种到4mL液体LB培养基中(含Amp100μg/mL)，放置摇床中37℃200rpm过夜。次日用过夜培养的菌液提取质粒。

(2)LAMP反应：

使用NanoDrop2000测定提取的质粒浓度为500ng/μL；然后用DEPC水进行10倍比稀释，取2μL上述作为模板，加入本实施例的检测试剂盒中，其中外引物F3(浓度10μM)：0.5μl；外引物B3(浓度10μM)：0.5μl；内引物FIP(浓度40μM)：1μl；内引物BIP(浓度40μM)：1μl；环引物LF(浓度20μM)：1μl；环引物LB(浓度20μM)：1μl；2×反应缓冲液(RM)：12.5μl；Bst DNA聚合酶：1μl，去离子水(DW)：3.5μL，FD(钙黄绿素)：1.0μL，共25μl的检测体系。将检测体系置于62℃的水浴锅中60min，80℃恒温5min或95℃恒温2min，使酶灭活以终止反应。

(3)检测：

使用Loopamp朗报荧光目视检测试剂盒(主要成分为钙黄绿素)，可以通过目测对结果进行判定。反应呈阳性的样品会变成绿色，而阴性的样品则保持橙红色。结果参见图1，从图1中可知：含有辣椒叶脉黄化病毒的PCR管中液体变为绿色，而不含辣椒叶脉黄化病毒的PCR管中液体保持染料原有的橙红色。

对比例1：

一种采用RT-PCR检测植株中辣椒叶脉黄化病毒的方法，具体包括以下步骤：

(1)提取植株总RNA，反转录成cDNA，同实施例1。

(2)PCR反应：使用NanoDrop2000测定提取的质粒浓度为500ng/μL，然后用DEPC水进行10倍比稀释，质粒模板十倍稀释9个浓度(分别是10^-1～10^-9)，-20℃保存作为模板，取1μL上述模板，以F3和B3为引物进行PCR扩增(使用常规PCR反应体系)得到扩增产物。

(3)检测：取2.5μL步骤(2)中得到的扩增产物、2μL loading buffer、3μL SYBR Green I(1∶5000)上样，在2％琼脂糖凝胶电泳。

对比实施例2的RT-LAMP的检测方法与对比例1中RT-PCR的灵敏度。图2中A图为本发明实施例2的LAMP体系灵敏度反应图；B图为对比例1的常规PCR体系灵敏度图，1-9为10^-1～10^-9的质粒浓度，10号空白对照。比较图A和图B，用RT-LAMP方法可以检测到浓度为10^-8的PeVYV的质粒浓度，而RT-PCR只能检测到浓度是浓度为10^-7的PeVYV的质粒浓度，所以RT-LAMP比RT-PCR灵敏性高出10倍。

实施例3：考察RT-LAMP反应过程中反应温度对检测效果的影响。

(1)提取植株总RNA，反转录成cDNA，同实施例1。

(2)LAMP反应：

使用NanoDrop2000测定提取的质粒浓度50ng/μL，然后用DEPC水进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。取2μL上述模板，加入实施例1的检测试剂盒中得到检测体系。将配置好的体系分别放置于温度为60、62、64、66℃下恒温条件下反应60min，然后在80℃下恒温5min后观察体系的颜色的变化。

(3)检测：

使用Loopamp朗报荧光目视检测试剂盒(主要成分为钙黄绿素)，可以通过目测对结果进行判定。反应呈阳性的样品会变成绿色，而阴性的样品则保持橙红色。

图3为LAMP温度梯度实验图结果，从图中可知：在相同的反应体系条件下，在60℃、62℃、64℃、66℃下反应，可以看出4个温度下都反应良好，取62℃为最佳温度。

实施例4：考察RT-LAMP反应过程中反应时间对检测效果的影响。

(1)提取植株总RNA，反转录成cDNA，同实施例1。

(2)LAMP反应：

使用NanoDrop2000测定提取的质粒浓度50ng/μL，然后用DEPC水进行10倍比稀释，-20℃保存作为模板。取2μL上述模板，加入实施例1的检测试剂盒中得到检测体系。将检测体系平均分为6份，在60℃恒温条件下分别反应30min、45min、60min、75min，然后在80℃反应5min使反应终止。

(3)检测：

使用Loopamp朗报荧光目视检测试剂盒(主要成分为钙黄绿素)，可以通过目测对结果进行判定。反应呈阳性的样品会变成绿色，而阴性的样品则保持橙红色。

图4为LAMP时间梯度实验图结果，从图中可知：在相同的反应体系条件下，当反应时间为45min时，颜色变为绿色，后面时间越长，颜色也没有保持绿色，因此本发明确定的RT-LAMP的反应时间为45～75min效果较优。

实施例5：辣椒叶脉黄化病毒RT-LAMP反应的特异性试验。

选择了另外五个背景明确的辣椒样品(分别编号为A1、A2、A3、A4、A5，都进行了sRNA测序，没有PeVYV)及一株健康的辣椒(编号为A6)为模板按照实施例1的方法进行RT-LAMP检测。如果反应能进行，则说明LAMP反应或者设计的引物特异性不好，如果反应不能进行，则说明该方法特异性良好。

具体步骤：

(1)提取六个辣椒样品叶片总RNA并反转录，得到cDNA，测定cDNA浓度。

(2)将六个样品的cDNA作为模板进行LAMP反应，反应完毕后观察体系颜色变化。

图5为LAMP特异性实验结果图，从图中可知，A1、A2、A3、A4、A5、A6都保持橙红色，7号变为绿色，表明本发明建立的RT-LAMP检测方法具有很好的特异性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

SEQUENCE LISTING

序列表

<110> 贵州省植物保护研究所

<120> 检测辣椒叶脉黄化病毒的引物组合物、试剂盒及其应用

<130> nm:

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 根据实验要求而设计，作为引物组合物的外引物F3。

<400> 1

CACAC GGCGA GGAAA TCG 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为引物组合物的外引物B3。

<400> 2

ACGAA GCGTA TGTTG ACCAT 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(41)

<223> 根据实验要求而设计，作为引物组合物的内引物FIP。

<400> 3

TTGCT CGACC TTCCT CCAAC TCAGA CGACG AAATG GAGGC A 41

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(42)

<223> 根据实验要求而设计，作为引物组合物的内引物BIP。

<400> 4

TCAGG ATCTG TCACC TTCGG GCAGG CTTTG AGAAC TCCAC CT 42

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 根据实验要求而设计，作为引物组合物的环引物LF。

<400> 5

TCTCG GCTTC TTCGG TTCC 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为引物组合物的环引物LB。

<400> 6

TCAGA GAGCG TCGCG CTTTC 20