本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种miRNA-122检测试剂盒及应用。
背景技术：
：microRNAs是在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源内源性染色体上的非编码单链小分子RNA，其长度为21～25nt，在进化上具有高度的保守性，能够通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区域(3’untranslatedregion，3’UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。miRNA参与调控真核生物超过1/3以上基因的表达、抑制靶基因的翻译、引起mRNA的降解等，具有非常重要的生物学功能。进一步研究表明，miRNAs在细胞增殖、分化和凋亡、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏形成、胚胎发育，生物个体死亡等过程中发挥着关键性的作用，这些最新的研究发现为我们提供了全新的疾病发生、发展调控网络，拓展了我们对疾病发生机制的理解和认识。miRNAs可存在于人体的多种体液中，具有严格的时空性和组织特异性。循环miRNAs是正常细胞或肿瘤细胞释放到血清/血浆的miRNAs，与目前临床常用的蛋白质类、激素类标志物相比，可更早预测和发现疾病发生发展状态。循坏miRNAs是基因表达水平的新型疾病相关特异性生物标志物，在临床实验诊断领域具有巨大的潜能和优势，无疑将极大地提高重大疾病的诊断和治疗水平。快速、准确、灵敏的miRNAs检测技术是确保循坏miRNAs生物标志物成功应用于临床的关键环节。目前，检测miRNAs的方法主要有Northern印迹分析、基因芯片和实时定量PCR等，但是，由于上述方法都需要预先对样本进行反转录和PCR扩增，才能完成检测，这样既大为增加了检测复杂性和检测时间，又一定程度上干扰了miRNAs的定量检测，同时预扩增存在的实验室污染问题也极大地影响了这些检测方法的准确性，使得这些方法的临床实际应用受到了极大的限制。肝损伤是所有肝脏疾病共有的病理状态，存在于肝病的整个发生和进展期，严重危害人类健康。临床常常通过肝功能生化指标检查，例如检测血液中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和胆红素等了解肝脏是否发生病变，以及肝脏的受损程度等信息。但由于这些常规肝功指标的特异性不高，容易受其它因素例如骨骼肌损伤、肌炎和剧烈运动等等的影响，目前亟需一种更加特异和灵敏反应肝损伤的检测标志物。MicroRNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长约19-23个核苷酸的非编码小RNA分子，其对细胞发育、分化、增殖和凋亡至关重要，调控并影响了整个生命活动的过程。目前大量研究已证实，miRNA-122几乎只表达于人体肝脏中，并且表达丰度很高。由于肝损伤过程中会发生肝细胞的凋亡或裂解，细胞内的miRNA-122便会释放到人体外周血中，并且miRNA分子在血液中较为稳定，相对不易降解，因此通过检测血液中的miRNA-122分子含量，可有效评估肝损伤的程度。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种miRNA-122检测试剂盒及应用。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种miRNA-122检测试剂盒，它包括反转录引物、检测引物、质控品和标准品，其中，所述反转录引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACC-3’；所述检测引物的上游引物序列如SEQIDNO.2所示，具体为：5’-GAGGCTGGAGTGTGACAATGG-3’，检测引物的下游引物序列如SEQIDNO.3所示，具体为：5’-TATCCTACGCAGGGTCCGAG-3’；所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品，阴性质控品为合成的线虫来源的cel-miRNA-39，阳性质控品为合成的人源的miRNA-122；所述标准品的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具体为：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACCATTGTCACACTCCA-3’。进一步地，所述阴性质控品的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具体为：5’-ucaccggguguaaaucagcuug-3’。进一步地，所述阳性质控品的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具体为：5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。进一步地，所述检测试剂盒由反转录缓冲液、反转录酶、PCR缓冲液、超纯水、质控品和标准品组成；其中，所述反转录缓冲液由dNTPs、RTBuffer、RNaseinhibitor、反转录引物和超纯水组成；所述PCR缓冲液由PCRBuffer、检测引物和超纯水组成；所述标准品包括5个不同浓度的标准品S1、标准品S2、标准品S3、标准品S4和标准品S5，其浓度分别为106copies/ul、105copies/ul、104copies/ul、103copies/ul和102copies/ul。上述的试剂盒用于检测miRNA-122。进一步地，所述的试剂盒用于检测肝损伤中的miRNA-122。上述试剂盒基于荧光定量PCR平台，检测样本类型包括血浆或血清。本发明试剂盒中标准品的使用方法为：本试剂盒中提供的标准品S1、S2、S3、S4和S5线性范围为102～106copies/ul，用于荧光定量PCR标准曲线的制作，标准曲线可用于精确计算待测样本中miRNA-122的浓度(copies/ul)。注意将原样本反应体系中的反转录样品3ul替换为本标准品3ul，反应条件与原样本一致。检测结果计算：通过标准曲线读取待测样本的miRNA-122浓度后，根据提取的样本体积，总RNA总RNA(包含总microRNA)的溶解体积，反转录上样体积和荧光定量上样体积计算出原血浆或血清样本中的miRNA-122浓度。例如：提取体积为Aul的血浆样本，得到体积为Bul的总RNA，取其中2ul用于反转录，荧光定量PCR上样3ul进行检测，读取的miRNA-122浓度为Ccopies/ul，则受试者血浆中miRNA-122的浓度(Xcopies/ul)按以下公式进行计算：X(copies/ul)＝C×20×15/3×B/2×1/A＝50BC/A上述阳性质控品和阴性质控品的使用方法为：在提取待测血浆或血清样本总RNA(包括总microRNA)的同时，也用相同的试剂盒和方法提取阳性质控品和阴性质控品。1.阳性质控品检测结果应满足：105～2×105copies/ul，否则实验无效。2.阴性质控品检测结果应为0copies/ul，否则实验无效。本发明试剂盒检测结果的解释方法为：1.miRNA-122浓度的检测结果小于或等于3×104copies/ul时，可直接报告结果为阴性。2.miRNA-122浓度的检测结果在3×104～6×104copies/ul范围内时，可直接报告结果为阳性，并建议对此份标本谨慎跟踪。3.miRNA-122浓度的检测结果大于等于6×104copies/ul时，可直接报告结果为阳性。4.阴性结果表示肝脏正常无损伤，阳性结果表示存在肝损伤。本发明具有以下优点：1.本发明试剂盒提供的反转录缓冲液和PCR缓冲液不但在组分上进行了优化有利于长期稳定保存，同时可将加样工作量简化至最小，以减少加样时可能出现的失误或误差，有利于得到稳定可靠的检测结果；2.本发明试剂盒提供了一种新的检测肝损伤的方法，选择的检测靶点miRNA-122仅表达于肝脏，因此特异性优于现有技术；3.本发明试剂盒选择用患者血清、血浆或全血为样本，保存方便，并且由于血细胞中不含miRNA-122，由采样或保存手法所导致的样本溶血或白细胞破裂等不会影响检测的结果，因此检测不但非侵入性，减少病人痛苦，且准确性不低于现有技术；4.本发明试剂盒基于荧光定量PCR平台，因此检验灵敏度高。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例1：miRNA-122检测试剂盒所述检测试剂盒由9ul反转录缓冲液、1ul反转录酶、17ul的PCR缓冲液、20ul超纯水、200ul阳性质控品、200ul阴性质控品和标准品组成；其中，所述反转录缓冲液由100mMdNTPs(withdTTP)0.15ul、10×RTBuffer1.5ul、10mg/mlRNaseinhibitor0.2ul、10uM反转录引物1ul和超纯水组成6.15ul；所述反转录引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，具体为：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACC-3’；所述反转录酶为分装自ABI公司的MultiScribeTMReverseTranscriptase，50U/μL。所述PCR缓冲液由2×PCRBuffer10ul(分装自Roche公司的FastStartEssentialDNAGreenMaster)、10uM检测上引物0.5ul、10uM检测下引物0.5ul和超纯水6ul组成；所述检测引物的上游引物序列如SEQIDNO.2所示，具体为：5’-GAGGCTGGAGTGTGACAATGG-3’，检测引物的下游引物序列如SEQIDNO.3所示，具体为：5’-TATCCTACGCAGGGTCCGAG-3’；所述标准品包括5个不同浓度的标准品S13ul、标准品S23ul、标准品S33ul、标准品S43ul和标准品S53ul，其浓度分别为106copies/ul、105copies/ul、104copies/ul、103copies/ul和102copies/ul。所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品，阴性质控品为合成的线虫来源的cel-miRNA-39，阳性质控品为合成的人源的miRNA-122；所述标准品的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，具体为：5’-CGACTATCCTACGCAGGGTCCGAGGTATTCGCGTAGGATAGTCGCAAACACCATTGTCACACTCCA-3’。所述阴性质控品的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，具体为：5’-ucaccggguguaaaucagcuug-3’。所述阳性质控品的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，具体为：5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’。实施例2：检测肝移植术后病人血浆中的miRNA-122的表达水平1、样本采集及处理使用普通EDTA采血管采集健康人和肝移植受者血液5ml，分别共10份。将血液转移至新的15ml离心管中，4℃2000g离心10min，吸取上层血浆至一新的15ml离心管中。再将血浆4℃4000g离心20min，吸取上层血浆至一新的15ml离心管中。吸取200ul并使用QIAGEN的miRNeasySerum/PlasmaKit按照操作说明书进行总RNA(包括总microRNA)的提取，同时也进行等体积阳性质控品和阴性质控品总RNA的提取，得到最终待测总RNA体积为40ul。2、实验检测将待测样本、阳性质控品和阴性质控品提取后的总RNA(包括总microRNA)按下述反应体系和反应条件进行反转录后，miRNA-122反转录反应体系如表1所示，miRNA-122反转录反应条件如表2所示，将反转录后的待测样本、阳性质控品、阴性质控品和标准品S1-S4的反应体系按照上述说明在96孔板中进行配置混匀，板式离心机短暂离心5s后，置于Bio-radCFXconnect荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件按照下述说明进行，miRNA-122荧光定量PCR检测反应体系如表3所示，miRNA-122荧光定量PCR检测反应条件如表4所示，在每个循环第二步即，60℃1min收集荧光信号。每管反应做5个副孔。表1：miRNA-122反转录反应体系成分体积反转录缓冲液9ul反转录酶1ulRNA样品(5～50ng)2ul超纯水3ul共计15ul表2：miRNA-122反转录反应条件表3：miRNA-122荧光定量PCR检测反应体系成分体积PCR缓冲液17ul反转录样品3ul共计20ul表4：miRNA-122荧光定量PCR检测反应条件3、实验结果检测结果经副孔计算取平均值后，见表5(结果取小数点后1位)表5.荧光定量PCR仪检测miRNA-122结果样本类型检测结果(copies/ul)健康人1852.4肝移植受者11231.6阳性质控品16224.2阴性质控品0经计算，阳性质控品的浓度为(16224.2×50×40)/200＝1.62242×105copies/ul，阴性质控品的浓度为0copies/ul，符合试剂盒说明，因此本次实验结果有效。经计算，健康人的miRNA-122浓度为(1852.4×50×40)/200＝1.8524×104copies/ul，小于3×104copies/ul，因此排定为阴性。肝移植受者的miRNA-122浓度为(11231.6×50×40)/200＝1.12316×105copies/ul，大于6×104copies/ul，因此判定为阳性。SEQUENCELISTING<110>成都仕康美生物科技有限公司<120>一种miRNA-122检测试剂盒及应用<130>2016<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>52<212>DNA<213>人工序列<400>1cgactatcctacgcagggtccgaggtattcgcgtaggatagtcgcaaacacc52<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2gaggctggagtgtgacaatgg21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3tatcctacgcagggtccgag20<210>4<211>66<212>DNA<213>人工序列<400>4cgactatcctacgcagggtccgaggtattcgcgtaggatagtcgcaaacaccattgtcac60actcca66<210>5<211>22<212>RNA<213>人工合成<400>5ucaccggguguaaaucagcuug22<210>6<211>22<212>RNA<213>人工合成<400>6uggagugugacaaugguguuug22当前第1页1 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