表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用的制作方法

本发明涉及一种病毒复制系统及其应用，特别涉及一种表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术：

西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)属黄病毒科，黄病毒属，是一种重要的人兽共患传染病病毒，能引起人严重的神经系统疾病。WNV病毒颗粒直径约40nm～60nm，有囊膜，膜内的病毒核衣壳呈二十面体对称，直径约30nm。WNV基因组为一条单链正义RNA，长约11kb。基因组由5’端长96nt和3’端长337-649nt的非编码区(UTR)及一个长约10.3kb的单一开放阅读框(open reading frame,ORF)构成。ORF从5’端97位起始，至3’端10398位终止，编码1个全长为3433个氨基酸的多聚蛋白前体，经宿主和病毒蛋白酶的切割加工后产生3种结构蛋白：C蛋白(衣壳/核心蛋白)、prM/M(膜前体蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)以及7种非结构蛋白。

西尼罗病毒病是由西尼罗病毒引起的传染病，是一种人兽共患病。该病对我国来说是外来病，目前在中国内地还未见报道，但中国的气候、地理环境复杂，蚊虫种类繁多，具备传播条件，且俄罗斯、印度等周边国家已有该病的流行，随着国际交流的日益频繁，WNV传入中国境内的可能性不容忽视，如近年来已经从新疆的蚊中分离出了WNV的报道。所以对我国而言，WNV流行爆发的风险非常大，且目前还没有疫苗或有效的药物来预防和治疗感染西尼罗河病毒，所以有必要研究相应预防控制措施。但WNV是人兽共患性病原，疫苗等相关研究的活病毒操作需要在高等级生物安全实验室进行，这在一定程度上阻碍了相关疫苗与药物研究。

为了促进WNV疫苗研制以及筛选新抗病毒药物，本发明构建了缺失全部结构蛋白的全病毒基因组，并在其结构蛋白区域插入GFP报告基因的WNV复制子质粒pWNVrepGFP-dCME，以及构建了稳定表达C-prM-E蛋白的细胞系；复制子质粒、重组细胞系与包装的△WNV病毒构成了一个限制性复制的西尼罗病毒系统。本发明的复制缺陷型西尼罗病毒系统可为西尼罗病毒的流行病学调查、疫苗评价、抗病毒药物筛选和西尼罗河病毒复制和发病机理的研究提供安全、简便的方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达绿色荧光蛋白且只能在系统内具有感染性与复制能力的西尼罗病毒(WNV)制备系统，以应用于安全、可视化的、类似于全病毒感染与复制的WNV中和抗体检测系统及药物筛选方法。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统，包括：

(1)西尼罗病毒限制性复制子质粒：

所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒是通过将西尼罗病毒基因组克隆到真核表达载体的启动子下游，并同时将基因组中的结构蛋白C-prM-E序列替换为绿色荧光蛋白基因后得到的；

(2)稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞系

所述的重组细胞系是通过将含有西尼罗病毒C-prM-E蛋白表达基因的真核表达载体转染哺乳动物细胞后得到的。

在本发明中，优选的，所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒的构建中，所采用的真核表达载体为pCI-neo。

在本发明中，优选的，所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，优选的，所述的稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞系是将含有优化后的西尼罗病毒C-prM-E蛋白表达基因的真核表达载体转染哺乳动物细胞后得到的，更优选的，所述的真核表达载体为pCAG-neo，所述的哺乳动物细胞为BHK-21细胞。

在本发明中，优选的，所述的优化后的西尼罗病毒C-prM-E蛋白表达基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，优选的，所述的稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞系是通过以下方法构建得到的：

(1)人工合成优化后的C-prM-E蛋白表达基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，优化后的序列命名为opti-WNV-CME，进行人工合成后通过PCR方法扩增优化后的序列，并在PCR产物的5′端引入Sac Ⅰ酶切位点，3′端引入Xho Ⅰ酶切位点，双酶切后的PCR产物与同样双酶切的pCAG-neo载体相连，连接产物转化DH5а后，挑选重组克隆、经酶切和测序鉴定，获得阳性克隆后用试剂盒大量制备质粒，命名为pCAG-WNV-CME，用SspI进行线性化后冻存于-20℃备用；

(2)选生长状态良好的BHK-21细胞消化传代至24孔板中，待BHK-21细胞长至90％满时，用线性化后的重组质粒pCAG-WNV-CME转染细胞，获得稳定表达的稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞系，命名为BWNV-CME。

进一步的，本发明还提出了所述的系统在获得表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种获得表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒的方法，包括以下步骤：

以含有10％(v/v)FBS的DMEM培养基为生长培养基，1：4传代培养本发明所述的稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞系，将对数生长期的重组细胞以5×10⁵/ml接种6孔细胞培养板，过夜培养，将本发明所述的西尼罗病毒限制性复制子质粒加入Opti-MEM中制成DNA稀释液，每3μg质粒加入200μl opti-MEM，加入20μl X-treme HP转染试剂，室温静置15min，将DNA转染试剂复合物逐滴加入含有稳定表达西尼罗病毒C-prM-E蛋白的重组细胞的培养液中，72h后观察荧光。收取上清，离心过滤后储存于－80℃备用。

再进一步的，本发明还提出了按照所述的方法获得的表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒以及所述的表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒在制备西尼罗病毒中和抗体检测试剂以及筛选抗西尼罗病毒药物中的用途。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明研制成的WNV复制缺陷型病毒是利用缺失结构蛋白基因的基因组复制子转染稳定表达WNV C-prM-E蛋白的细胞系BWNV-CME进行△WNV病毒粒子包装，该病毒基因组中的结构蛋白基因被表达绿色荧光蛋白的基因所取代，因此在病毒复制子复制过程中，由于其不能自身表达结构蛋白而无法继续产生子代病毒，但可以大量表达GFP蛋白，对感染细胞具有极强的指示作用。而只有当与外源提供的WNV C蛋白(衣壳/核心蛋白)、prM/M(膜前体蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)重新装配后才能够整合成完整的病毒粒子。在复制缺陷型病毒中和试验中，WNV复制缺陷型病毒能被中和抗体有效中和而失去对宿主细胞的感染作用。因为WNV复制缺陷型病毒含有报告基因，能够表达绿色荧光蛋白，因此可以利用荧光显微镜直观的观测到被病毒感染的细胞。使用WNV复制缺陷型病毒代替野生型WNV进行中和抗体的检测时，只需将一定剂量的复制缺陷型病毒同待检样品共同孵育1h后，直接感染易感细胞BHK-21，48h后将细胞置于荧光显微镜下观测荧光密度，用来评价待检样品中的中和抗体，该操作相较于活病毒操作具有极高的安全性与简便性，不依赖于BSL-3高等级生物安全条件，节省时间，提高效率。同时因为WNV复制缺陷型病毒是复制缺陷型的，因此所加入的病毒量是个固定的数值，不会因感染易感细胞而产生病毒的增殖，更加有利于进行抗体检测时的定性与定量检测。

附图说明

图1为WNV复制子构建示意图；

图2为重组质粒pWNVrep-GFP-dCME的酶切鉴定；

1：DL 15000DNA Marker；2：双酶切前；3：双酶切后。

图3为重组质粒pCAG-WNV-CME的酶切鉴定；

1：DL 15000DNA Marker；2、3：双酶切前；4、5：双酶切后。

图4为重组细胞系E蛋白特异性单克隆抗体IFA检测；

图5为△WNV感染BWNV-CME细胞形成的荧光斑与噬斑；

图6为△WNV病毒的复制动力学曲线；

图7为△WNV病毒感染特性；

图8为用WNV限制性复制病毒系统检测药物抗WNV活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统的构建

1材料和方法

1.1载体、细胞及主要试剂

表达载体质粒pCAG-neo质粒(李业南等，中国预防兽医学报，2013,35(3)::189-192；Hua RH,et al,BMC Biotechnology,2014,14:62)和PCAG-WNV质粒(郭立平.稳定表达西尼罗病毒prM-E蛋白细胞系的构建[D].中国农业科学院,2015)按文献报道方法构建；BHK-21细胞由本实验室保存，W-92细胞系由本实验室构建。DMEM、优等胎牛血清(FBS)和Opti-MEM购自Gibco公司；X-treme HP转染试剂购自Roche公司；FITC标记山羊抗鼠IgG购自中杉金桥公司；红外荧光标记的抗鼠IgG抗体购自哈尔滨兽医研究所公共实验室；E蛋白和NS1蛋白单克隆抗体由本实验室制备；WNV鼠阳性血清由本实验室保存。

1.2复制子质粒pWNVrepGFP-dCME构建

通过参考WNV病毒基因组序列(NY99株，Genbank序列号DQ211652NY99),采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基，人工合成基因组片段，通过克隆位点Xho I和Xba I连接到真核表达质粒pCI-neo的CMV启动子下游构建WNV复制子质粒，WNV复制子基因组中结构蛋白C-prM-E序列替换为绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因，获得的重组质粒命名为pWNVrepGFP-dCME。复制子各主要元件如图1所示。pWNVrepGFP-dCME的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

1.3质粒pCAG-WNV-CME构建

首先运用生物信息学方法对编码WNV C-prM-E蛋白基因进行密码子优化，优化后的C-prM-E蛋白基因序列如SEQ ID NO.2所示，优化后的序列命名为opti-WNV-CME，进行人工合成后通过PCR方法扩增优化后的序列，并在PCR产物的5′端引入Sac Ⅰ酶切位点，3′端引入Xho Ⅰ酶切位点，双酶切PCR产物与同样双酶切的pCAG-neo载体相连，连接产物转化DH5а后，挑选重组克隆、经酶切和测序鉴定，获得阳性克隆后用试剂盒大量制备质粒，命名为pCAG-WNV-CME，用SspI进行线性化后冻存于-20℃备用。

1.4重组细胞系的构建与筛选鉴定

选生长状态良好的BHK-21细胞消化传代至24孔板中，待BHK-21细胞长至90％满时，按照HD Transfection Reagent转染试剂盒操作说明用线性化后的重组质粒pCAG-WNV-CME转染细胞。转染48h后加入含G418(1000μg/mL)选择性培养基进行加压培养，4d后将细胞用胰酶消化，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，5d后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目。挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔相继在24孔板、6孔板、细胞培养瓶中扩大培养，同时对各细胞用WNV E蛋白特异性单克隆抗体进行IFA鉴定，筛选IFA信号较强的细胞克隆。获得稳定表达C-prM-E蛋白的细胞克隆，命名为BWNV-CME。

1.5△WNV病毒的包装及保存

以含有10％FBS的DMEM培养基为生长培养基，1：4传代培养BWNV-CME细胞，将对数生长期的BWNV-CME细胞以5×10⁵/ml接种6孔细胞培养板，过夜培养，将质粒pWNVrep-GFP-dCME加入Opti-MEM中制成DNA稀释液，每3μg质粒需要200μl opti-MEM，加入20μl X-treme HP转染试剂，室温静置15min。将DNA转染试剂复合物逐滴加入含有BWNV-CME细胞的培养液中，72h后观察荧光。收取上清，离心过滤后储存于－80℃备用。

1.6△WNV病毒PFU测定

取收获转染细胞所包装的病毒上清15ul，补加135ul 5％FBS DMEM,经过一系列10倍稀释，六孔板每孔加100ul，37℃，5％CO₂培养箱培养10h后向每孔中加入培养基等体积的3％甲基纤维素，培养48h后观察绿色荧光蛋白表达。或培养6天后用结晶紫液染色计数病毒噬斑。

1.7包装病毒复制动力学

为了观察转染细胞包装病毒的生长动力学过程，对所制备的包装病毒在BWNV-CME细胞中感染与复制情况进行了分析，分别在感染后24h、48h、72h、96h、120h收取上清并且测其滴度。

2结果

2.1质粒pWNVrepGFP-dCME构建

质粒pWNVrepGFP-dCME构建示意图见图1。该质粒以wnv病毒基因组序列为基础，5’为CMV与T7启动子，为保证转录后3’端序列的精确性，3’端加有丁肝核酸酶序列(HDr)。质粒经NotⅠ和SalI双酶切鉴定结果如图2，酶切片段大小为8000bp和5000bp左右，与预期结果一致，正反向测序确认插入序列正确。

2.2质粒pCAG-WNV-CME构建

双酶切PCR产物与双酶切的pCAG-neo载体相连后，转化涂板，挑单克隆菌，提取质粒后用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切验证，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段2400bp左右，与预期相符。且序列测定结果表明序列与预期一致(图3)。

2.3重组细胞系的筛选鉴定

将线性化的质粒转染BHK-21细胞后，用G418进行筛选，细胞经克隆后用单克隆抗体进行IFA鉴定(图4)。结果得到一株表达C-prM-E蛋白蛋白的细胞系，命名为BWNV-CME。该细胞系经再次克隆纯化后进行传代培养与检测表明该细胞系遗传稳定，在连续传代20代后依然能稳定表达E蛋白。重组细胞系的培养生长特性与亲本细胞BHK-21细胞相似，以1：5的比率进行传代培养，培养基为含10％胎牛血清的DMEM液，隔天即可再传代。

2.4△WNV病毒PFU测定

收获复制缺陷型病毒△WNV上清100μl经一系列10倍稀释感染BWNV-CME细胞，48h后，倒置显微镜下观察每孔表达GFP细胞数，并计数，测得病毒效价为为1×10^5.5PFU/ml。△WNV感染BWNV-CME细胞形成的荧光斑与噬斑如图5所示。

2.5△WNV病毒复制动力学

转染后分别在24h、48h、72h、96h、120h收取上清并且测其效价并绘制动力学曲线图6，结果表明24～72h，病毒滴度总体呈上升趋势，72h到96h处于平台期，96h后稍有下降，结果表明，构建的复制缺陷型病毒具有良好的复制活性，而且确定了收毒最佳时间为转染后72h-96h之间。

2.6△WNV具有限制性复制特性

同时转染pWNVrep-GFP-dCME和pCAG-WNV-CME的细胞培养上清能够在第一次感染的BHK-21细胞中表达GFP，而单纯转染pWNVrep-GFP-dCME或pCAG-WNV-CME质粒的细胞培养上清则不能感染BHK-21细胞，无GFP表达。质粒pWNVrep-GFP-dCME转染BWNV-CME细胞系产生病毒△WNV在细胞系BWNV-CME上具有感染性，能产生仔代病毒，产生荧光斑与形成病毒噬斑，而且在第二轮与第三轮感染BWNV-CME细胞系时保持病毒感染特性。而感染BHK-21细胞的上清则不具有第二轮感染性，其上清再接种到BHK-21细胞时，细胞不能表达GFP。由此我们可以得出通过本发明的复制限制性WNV病毒只能在本系统内的特定细胞系中具有类似于全病毒复制的特性，而其共他敏感细胞如BHK-21细胞中则只具有单轮感染性(图7)。

实施例2 表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统的应用

1方法

1.1限制性复制病毒系统用于WNV中和抗体检测

将4×10⁵/mL BWNV-CME细胞接种于24孔细胞培养板，500μL/孔，37℃、5％CO2培养过夜，使细胞长成单层；将WNV阳性血清及阴性血清灭活后从1：10开始梯度稀释后与等体积的△WNV混合，设置复孔，于37℃、5％CO2培养箱放置1h；之后将△WNV病毒抗体混合液100μl接种于单层BWNV-CME细胞，37℃、5％CO2培养6h后加入3％甲基纤维素DMEM液，培养3天后观察绿色荧光表达。6天后进行噬斑计数。以荧光斑或噬斑减少50％为判定终点，计算各待测血清的中和抗体效价。

1.2限制性复制性病毒系统用于WNV抗病毒药物筛选

将4×10⁵cell/mL BWNV-CME细胞接种于24孔细胞培养板，500μL/孔，37℃、5％CO₂培养过夜，使细胞长成单层；将丹宁酸(Tannic acid)，6-氮杂尿苷(6-azauridine)等药物用DMSO配制为10mM贮液，再用DMEM液稀释至20μM，1％DMSO为对照，将各药物及及对照加入至细胞中，作用10h后加入100TCID50/0.1ml的△WNV病毒，于37℃、5％CO₂培养箱放置10h后加入将△WNV病毒抗体混合液接种于单层BWNV-CME细胞，37℃、5％CO2培养6h后加入3％甲基纤维素DMEM液，培养3天后观察绿色荧光表达。6天后进行噬斑计数。以DMSO或空白处理孔为对照，计算各待测药物的病毒抑制率。

2结果

2.1中和实验检测WNV中和抗体

利用本发明的限制性复制WNV病毒系统对用WNV亚单位疫苗免疫的小鼠血清，鹅血清，以及马血清进行了病毒中和抗体检测，同时设立未免疫相应实验动物的阴性血清作为对照。结果表明，对疫苗免疫动物血清通过WNV限制性复制病毒系统的中和试验同样检测出中和活性，并且随着血清稀释度的增加，其对WNV复制缺陷型病毒的中和作用逐渐下降，而阴性对照血清对WNV复制缺陷型病毒并无中和作用，所有试验动物血清在二免后病毒中和抗体显著提高，可以为免疫动物提供免疫保护(表1)。表明本发明的WNV限制性复制病毒系统可用于检测血清中和抗体的分析。

表1 利用△WNV病毒系统检测WNV中和抗体

2.2用WNV限制性复制病毒系统筛选抗病毒药物

经用本发明的限制性复制病毒系统对已知的对WNV有抗病毒活性的药物的检测结果表明本系统可以用于筛选抗WNV病毒药物。本实例中两种药物均显示出了能抑制WNV病毒的复制，而DMSO对照则没有这种活性(图8)。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 表达绿色荧光蛋白的限制性复制西尼罗病毒系统及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 11713bp

<212> DNA

<213> pWNVrep-GFP-dCME

<400> 1

agtagttcgc ctgtgtgagc tgacaaactt agtagtgttt gtgaggatta acaacaatta 60

acacagtgcg agctgtttct tagcacgaag atctcgatgt ctaagaaacc aggagggccc 120

ggcaagagcc gggctgtcaa tatgctaaaa cgcggaatgg tgagcaaggg cgaggagctg 180

ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 240

agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 300

tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 360

gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 420

atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 480

acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 540

atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 600

cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 660

cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 720

atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 780

agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 840

gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagctgctga actttgacct gctcaagttg 900

gctggagatg tggagtccaa ccctggaccc tttaagaagg aactagggac cttgaccagt 960

gctatcaatc ggcggagctc aaaacaaaag aaaagaggag gaaagaccgg aattgcagtc 1020

atgattggcc tgatcgccag cgtaggagca gttaccctct ctaacttcca agggaaggtg 1080

atgatgacgg taaatgctac tgacgtcaca gatgtcatca cgattccaac agctgctgga 1140

aagaacctat gcattgtcag agcaatggat gtgggataca tgtgcgatga tactatcact 1200

tatgaatgcc cagtgctgtc ggctggtaat gatccagaag acatcgactg ttggtgcaca 1260

aagtcagcag tctacgtcag gtatggaaga tgcaccaaga cacgccactc aagacgcagt 1320

cggaggtcac tgacagtgca gacacacgga gaaagcactc tagcgaacaa gaagggggct 1380

tggatggaca gcaccaaggc cacaaggtat ttggtaaaaa cagaatcatg gatcttgagg 1440

aaccctggat atgccctggt ggcagccgtc attggttgga tgcttgggag caacaccatg 1500

cagagagttg tgtttgtcgt gctattgctt ttggtggccc cagcttacag cttcaactgc 1560

cttggaatga gcaacagaga cttcttggaa ggagtgtctg gagcaacatg ggtggatttg 1620

gttctcgaag gcgacagctg cgtgactatc atgtctaagg acaagcctac catcgatgtg 1680

aagatgatga atatggaggc ggccaacctg gcagaggtcc gcagttattg ctatttggct 1740

accgtcagcg atctctccac caaagctgcg tgcccgacca tgggagaagc tcacaatgac 1800

aaacgtgctg acccagcttt tgtgtgcaga caaggagtgg tggacagggg ctggggcaac 1860

ggctgcggac tatttggcaa aggaagcatt gacacatgcg ccaaatttgc ctgctctacc 1920

aaggcaatag gaagaaccat cttgaaagag aatatcaagt acgaagtggc catttttgtc 1980

catggaccaa ctactgtgga gtcgcacgga aactactcca cacaggttgg agccactcag 2040

gcagggagat tcagcatcac tcctgcggcg ccttcataca cactaaagct tggagaatat 2100

ggagaggtga cagtggactg tgaaccacgg tcagggattg acaccaatgc atactacgtg 2160

atgactgttg gaacaaagac gttcttggtc catcgtgagt ggttcatgga cctcaacctc 2220

ccttggagca gtgctggaag tactgtgtgg aggaacagag agacgttaat ggagtttgag 2280

gaaccacacg ccacgaagca gtctgtgata gcattgggct cacaagaggg agctctgcat 2340

caagctttgg ctggagccat tcctgtggaa ttttcaagca acactgtcaa gttgacgtcg 2400

ggtcatttga agtgtagagt gaagatggaa aaattgcagt tgaagggaac aacctatggc 2460

gtctgttcaa aggctttcaa gtttcttggg actcccgcag acacaggtca cggcactgtg 2520

gtgttggaat tgcagtacac tggcacggat ggaccttgca aagttcctat ctcgtcagtg 2580

gcttcattga acgacctaac gccagtgggc agattggtca ctgtcaaccc ttttgtttca 2640

gtggccacgg ccaacgctaa ggtcctgatt gaattggaac caccctttgg agactcatac 2700

atagtggtgg gcagaggaga acaacagatc aatcaccatt ggcacaagtc tggaagcagc 2760

attggcaaag cctttacaac caccctcaaa ggagcgcaga gactagccgc tctaggagac 2820

acagcttggg actttggatc agttggaggg gtgttcacct cagttgggaa ggctgtccat 2880

caagtgttcg gaggagcatt ccgctcactg ttcggaggca tgtcctggat aacgcaagga 2940

ttgctggggg ctctcctgtt gtggatgggc atcaatgctc gtgataggtc catagctctc 3000

acgtttctcg cagttggagg agttctgctc ttcctctccg tgaacgtgca cgctgacact 3060

gggtgtgcca tagacatcag ccggcaagag ctgagatgtg gaagtggagt gttcatacac 3120

aatgatgtgg aggcttggat ggaccggtac aagtattacc ctgaaacgcc acaaggccta 3180

gccaagatca ttcagaaagc tcataaggaa ggagtgtgcg gtctacgatc agtttccaga 3240

ctggagcatc aaatgtggga agcagtgaag gacgagctga acactctttt gaaggagaat 3300

ggtgtggacc ttagtgtcgt ggttgagaaa caggagggaa tgtacaagtc agcacctaaa 3360

cgcctcaccg ccaccacgga aaaattggaa attggctgga aggcctgggg aaagagtatt 3420

ttatttgcac cagaactcgc caacaacacc tttgtggttg atggtccgga gaccaaggaa 3480

tgtccgactc agaatcgcgc ttggaatagc ttagaagtgg aggattttgg atttggtctc 3540

accagcactc ggatgttcct gaaggtcaga gagagcaaca caactgaatg tgactcgaag 3600

atcattggaa cggctgtcaa gaacaacttg gcgatccaca gtgacctgtc ctattggatt 3660

gaaagcaggc tcaatgatac gtggaagctt gaaagggcag ttctgggtga agtcaaatca 3720

tgtacgtggc ctgagacgca taccttgtgg ggcgatggaa tccttgagag tgacttgata 3780

ataccagtca cactggcggg accacgaagc aatcacaatc ggagacctgg gtacaagaca 3840

caaaaccagg gcccatggga cgaaggccgg gtagagattg acttcgatta ctgcccagga 3900

actacggtca ccctgagtga gagctgcgga caccgtggac ctgccactcg caccaccaca 3960

gagagcggaa agttgataac agattggtgc tgcaggagct gcaccttacc accactgcgc 4020

taccaaactg acagcggctg ttggtatggt atggagatca gaccacagag acatgatgaa 4080

aagaccctcg tgcagtcaca agtgaatgct tataatgctg atatgattga cccttttcag 4140

ttgggccttc tggtcgtgtt cttggccacc caggaggtcc ttcgcaagag gtggacagcc 4200

aagatcagca tgccagctat actgattgct ctgctagtcc tggtgtttgg gggcattact 4260

tacactgatg tgttacgcta tgtcatcttg gtgggggcag ctttcgcaga atctaattcg 4320

ggaggagacg tggtacactt ggcgctcatg gcgaccttca agatacaacc agtgtttatg 4380

gtggcatcgt ttctcaaagc gagatggacc aaccaggaga acattttgtt gatgttggcg 4440

gctgttttct ttcaaatggc ttatcacgat gcccgccaaa ttctgctctg ggagatccct 4500

gatgtgttga attcactggc ggtagcttgg atgatactga gagccataac attcacaacg 4560

acatcaaacg tggttgttcc gctgctagcc ctgctaacac ccgggctgag atgcttgaat 4620

ctggatgtgt acaggatact gctgttgatg gtcggaatag gcagcttgat cagggagaag 4680

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gggctggcag agcttgacat tgactccatg gccattccaa tgactatcgc ggggctcatg 4920

tttgctgctt tcgtgatttc tgggaaatca acagatatgt ggattgagag aacggcggac 4980

atttcctggg aaagtgatgc agaaattaca ggctcgagcg aaagagttga tgtgcggctt 5040

gatgatgatg gaaacttcca gctcatgaat gatccaggag caccttggaa gatatggatg 5100

ctcagaatgg tctgtctcgc gattagtgcg tacaccccct gggcaatctt gccctcagta 5160

gttggatttt ggataactct ccaatacaca aagagaggag gcgtgttgtg ggacactccc 5220

tcaccaaagg agtacaaaaa gggggacacg accaccggcg tctacaggat catgactcgt 5280

gggctgctcg gcagttatca agcaggagcg ggcgtgatgg ttgaaggtgt tttccacacc 5340

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tacgaatgga tcacagaata caccgggaag acggtttggt ttgtgcctag tgtcaagatg 6300

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