一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法与流程

本发明属于分子生物学和病毒学技术领域，具体涉及一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法。

背景技术：

烟草花叶病毒属(tobamovirus)是帚状病毒科(virgaviridae)中病毒种类最多的一个属，根据2012年发布的国际病毒分类委员会(ictv)第九次大会报告，tobamovirus有25个确定种和6个暂定种，其代表种为tmv。而根据ictv最新的在线报告显示，tobamovirus已有35种病毒(http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp)。烟草花叶病毒属病毒在世界各地均有分布，能侵染茄科、十字花科、葫芦科等重要作物并引起严重危害，是最具经济重要性的病毒属之一。

目前为止，植物病毒中已有potyvirus、begomovirus、luteovirus等病毒属的通用检测引物，大大提高了这些病毒的检测效率。烟草花叶病毒属病毒种类多且侵染性强，尤其是在茄科作物上发病严重，但迄今没有该属病毒的通用检测引物，用单一的特异性检测引物检测疑似病毒的侵染，工作量大、成本高且繁琐。为此，建立烟草花叶病毒属病毒(tobamoviruses)快速、简便、灵敏的检测技术很有必要，将对调查分析tobamoviruses的发生、分布，为烟草花叶病毒属病毒种类的鉴定以及病害防控等提供技术支撑。

技术实现要素：

为了克服背景技术中存在的不足，本发明提出一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法，本发明检测方法简单，检测结果快速，灵敏度高。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物序列为：

正向引物tobamodf：5’-tkgayggngtbccnggntgygg-3’，

反向引物tobamodr：5’-acngavtbnabctgtaattgctat-3’；

进一步，所述引物对tmgmv扩增出871bp的产物，对pmmov扩增出877bp的产物，对tmv、tomv、tommv扩增出880bp的产物，对orsv扩增出889bp的产物，对cgmmv扩增出874bp的产物。

进一步，所述引物中n可以是a、c、g、t四种碱基中的任意一种，k为g和t中的一种，y为c和t中的一种，b为c、g、t中的一种，v为a、c、g中的一种。

进一步，设计该对引物时参照的烟草花叶病毒属中的32种病毒为甜椒斑驳病毒(bpmov)、曼陀罗轻型斑驳病毒(brmmv)、黄瓜果实斑驳花叶病毒(cfmmv)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)、仙人掌轻斑驳病毒(cmmov)、黄瓜斑驳病毒(cumov)、鸡蛋花花叶病毒(frmv)、木槿潜隐皮尔斯堡病毒(hlfpv)、木槿潜隐新加坡病毒(hlsv)、青瓜绿斑驳花叶病毒(kgmmv)、香果花叶病毒(marmv)、老布达胡椒病毒(obpv)、齿兰环斑病毒(orsv)、西番莲果花叶病毒(pafmv)、红辣椒轻型斑驳病毒(pammv)、辣椒轻斑驳病毒(pmmov)、秃马尾巴仙人掌坏死病毒(rcnav)、地黄花叶病毒(remv)、长叶车前草花叶病毒(rmv)、堇兰花裂病毒(sfbv)、菽麻花叶病毒(shmv)、烟草花叶病毒(tmv)、烟草轻绿花叶病毒(tmgmv)、番茄花叶病毒(tomv)、番茄斑驳花叶病毒(tommv)、芜菁脉明病毒(tvcv)、山榆菜斑驳病毒(wmov)、油菜花叶病毒(ymov)、黄色白星海轻斑驳病毒(ytmmv)、西葫芦绿斑驳花叶病毒(zgmmv)。

进一步，通过对烟草花叶病毒属已登录全序列的32种病毒进行序列同源性、系统进化关系以及寄主范围等分析，发现在这些病毒中tmv、tomv、tommv、pmmov、tmgmv、remv、bpmov、brmmv、ytmmv、pammv、obpv和orsv的核苷酸及氨基酸序列同源性较高，聚为一组，除了remv以侵染玄参科作物为主、orsv以侵染兰科作物为主外，其余病毒主要侵染茄科作物；sfbv、rmv、tvcv、ymov和wmov的核苷酸与氨基酸序列同源性较高，聚为一组，主要侵染十字花科作物；cgmmv、cumov、cfmmv、kgmmv和zgmmv的核苷酸与氨基酸序列同源性较高，聚为一组，主要侵染葫芦科作物；shmv和cymv核苷酸与氨基酸序列同源性最高，主要侵染豆科作物；cmmov和rcnav聚为一组，主要侵染仙人掌科作物；hlsv和hlfpv聚为一组，主要侵染锦葵科作物；marmv和pafmv聚为一组，主要侵染西番莲科作物；frmv单独一组，主要侵染夹竹桃科作物。

一种烟草花叶病毒属病毒通用检测方法包括以下具体步骤：

rt反应体系：反转录试剂盒为primescriptii1ststrandcdnasynthesiskit或takarareversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)kit，反应体系的总体积为10μl。primescriptii1ststrandcdnasynthesiskit具体方法为，将含1-2μl的模板，0.5μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，0.5μl10mmol/l的dntpmix，2-3μlddh2o的混合液混匀后65℃反应5min，反应结束迅速放冰上冷却，之后加入含2μl的5×primerscriptiibuffer，0.25μl40u/μl的rnaseinhibitor，0.5μl200u/μl的primerscriptiirtase，2.25μlddh2o的混合液，之后45℃反应1h，70℃反应15min终止反应。takarareversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)kit的具体方法为，将含2μl模板，1μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，3μlddh2o的混合样混匀后，70℃下反应10min，迅速拿出放在冰上冷却3min，之后加入含2μl5×m-mlvbuffer，0.5μldntpmix(10mm)，0.5μlrtasem-mlv，1μlddh2o的混合液，在42℃反应1h，70℃下15min反应结束；

pcr反应体系：pcr扩增试剂盒为2×estaqmastermix，反应体系的总体积为10μl，含5μl2×estaqmastermix，1μlcdna模板，0.2-0.4μl烟草花叶病毒属通用引物正向引物，0.2-0.4μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，3.2-3.6μlddh2o；

反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，45-55℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，循环30-35次；72℃延伸5-10min；4℃终止反应；

反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。

本发明的有益效果：本发明中的检测引物是基于烟草花叶病毒属中的32种病毒的基因组保守区序列进行设计，用该属中的7种病毒对该检测引物进行扩增效果验证，扩增效果均较好；从而建立了一种能够检测至少7种烟草花叶病毒属病毒的通用检测引物及方法，且具有检测效率高、灵敏度高、成本低的特点。

附图说明

图1是烟草花叶病毒属病毒通用检测引物设计图；

图2是引物组合tobamodf/tobamodr对7种烟草花叶病毒属病毒的rt-pcr检测结果电泳图；

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例和说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物序列为：

正向引物tobamodf：5’-tkgayggngtbccnggntgygg-3’，

反向引物tobamodr：5’-acngavtbnabctgtaattgctat-3’；

所述引物对tmgmv扩增出871bp的产物，对pmmov扩增出877bp的产物，对tmv、tomv、tommv扩增出880bp的产物，对orsv扩增出889bp的产物，对cgmmv扩增出874bp的产物。

所述的引物中n可以是a、c、g、t四种碱基中的任意一种，k为g和t中的一种，y为c和t中的一种，b为c、g、t中的一种，v为a、c、g中的一种。

设计该对引物时参照的烟草花叶病毒属中的32种病毒为甜椒斑驳病毒(bpmov)、曼陀罗轻型斑驳病毒(brmmv)、黄瓜果实斑驳花叶病毒(cfmmv)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)、仙人掌轻斑驳病毒(cmmov)、黄瓜斑驳病毒(cumov)、鸡蛋花花叶病毒(frmv)、木槿潜隐皮尔斯堡病毒(hlfpv)、木槿潜隐新加坡病毒(hlsv)、青瓜绿斑驳花叶病毒(kgmmv)、香果花叶病毒(marmv)、老布达胡椒病毒(obpv)、齿兰环斑病毒(orsv)、西番莲果花叶病毒(pafmv)、红辣椒轻型斑驳病毒(pammv)、辣椒轻斑驳病毒(pmmov)、秃马尾巴仙人掌坏死病毒(rcnav)、地黄花叶病毒(remv)、长叶车前草花叶病毒(rmv)、堇兰花裂病毒(sfbv)、菽麻花叶病毒(shmv)、烟草花叶病毒(tmv)、烟草轻绿花叶病毒(tmgmv)、番茄花叶病毒(tomv)、番茄斑驳花叶病毒(tommv)、芜菁脉明病毒(tvcv)、山榆菜斑驳病毒(wmov)、油菜花叶病毒(ymov)、黄色白星海轻斑驳病毒(ytmmv)、西葫芦绿斑驳花叶病毒(zgmmv)。

通过对烟草花叶病毒属已登录全序列的32种病毒进行序列同源性、系统进化关系以及寄主范围等分析，发现在这些病毒中tmv、tomv、tommv、pmmov、tmgmv、remv、bpmov、brmmv、ytmmv、pammv、obpv和orsv的核苷酸与氨基酸序列同源性较高，聚为一组，除了remv以侵染玄参科作物为主、orsv以侵染兰科作物为主外，其余病毒主要侵染茄科作物；sfbv、rmv、tvcv、ymov和wmov的核苷酸与氨基酸序列同源性较高，聚为一组，主要侵染十字花科作物；cgmmv、cumov、cfmmv、kgmmv和zgmmv的核苷酸与氨基酸序列同源性较高，聚为一组，主要侵染葫芦科作物；shmv和cymv的核苷酸与氨基酸序列同源性最高，主要侵染豆科作物；cmmov和rcnav聚为一组，主要侵染仙人掌科作物；hlsv和hlfpv聚为一组，主要侵染锦葵科作物；marmv和pafmv聚为一组，主要侵染西番莲科作物；frmv单独一组，主要侵染夹竹桃科作物。

一种烟草花叶病毒属病毒通用检测方法包括以下具体步骤：

rt反应体系：反转录试剂盒为primescriptii1ststrandcdnasynthesiskit或takarareversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)kit，反应体系的总体积为10μl。primescriptii1ststrandcdnasynthesiskit具体方法为，将含1-2μl的模板，0.5μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，0.5μl10mmol/l的dntpmix，2-3μlddh2o的混合液混匀后65℃反应5min，反应结束迅速放冰上冷却，之后加入含2μl的5×primerscriptiibuffer，0.25μl40u/μl的rnaseinhibitor，0.5μl200u/μl的primerscriptiirtase，2.25μlddh2o的混合液，之后45℃反应1h，70℃反应15min终止反应。takarareversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)kit的具体方法为，将含2μl模板，1μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，3μlddh2o的混合样混匀后，70℃下反应10min，迅速拿出放在冰上冷却3min，之后加入含2μl5×m-mlvbuffer，0.5μldntpmix(10mm)，0.5μlrtasem-mlv，1μlddh2o的混合液，在42℃反应1h，70℃下15min反应结束；

pcr反应体系：pcr扩增试剂盒为2×estaqmastermix，反应体系的总体积为10μl，含5μl2×estaqmastermix，1μlcdna模板，0.2-0.4μl烟草花叶病毒属通用引物正向引物，0.2-0.4μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，3.2-3.6μlddh2o；

反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，45-55℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，循环30-35次；72℃延伸5-10min；4℃终止反应；

反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。

实验分析：

一对用于检测感染烟草花叶病毒属病毒的通用检测引物tobamodf/tobamodr，其正向引物序列为：tobamodf：5’-tkgayggngtbccnggntgygg-3’，反向引物序列为：tobamodr：5’-acngavtbnabctgtaattgctat-3’。

一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物序列及方法，包括：

(1)烟草花叶病毒属病毒通用引物设计：

根据genbank上登录的烟草花叶病毒属病毒32种病毒全基因组核苷酸序列比对分析，设计了一对简并引物组合tobamodf/tobamodr，用于对感染烟草花叶病毒属的病毒进行检测。该对引物序列为正向引物tobamodf：5’-tkgayggngtbccnggntgygg-3’，反向引物tobamodr：5’-acngavtbnabctgtaattgctat-3’，扩增目的片段大小均为880bp左右。

(2)烟草花叶病毒属病毒通用引物rt-pcr检测验证：

利用ctab法，分别从感染了烟草花叶病毒属病毒tmv、tomv、tommv、tmgmv、pmmov、orsv和cgmmv的阳性样本中提取病株总核酸。然后用引物对tobamodf/tobamodr通过primescriptii1ststrandcdnasynthesiskit或takarareversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)kit对这7种病毒进行检测验证。primescriptii1ststrandcdnasynthesiskit具体方法为，将含1-2μl的模板，0.5μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，0.5μl10mmol/l的dntpmix，2-3μlddh2o的混合液混匀后65℃反应5min，反应结束迅速放冰上冷却，之后加入含2μl的5×primerscriptiibuffer，0.25μl40u/μl的rnaseinhibitor，0.5μl200u/μl的primerscriptiirtase，2.25μlddh2o的混合液，之后45℃反应1h，70℃反应15min终止反应。takarareversetranscriptasem-mlv(rnaseh^-)kit的具体方法为，将含2μl模板，1μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，3μlddh2o的混合样混匀后，70℃下反应10min，迅速拿出放在冰上冷却3min，之后加入含2μl5×m-mlvbuffer，0.5μldntpmix(10mm)，0.5μlrtasem-mlv，1μlddh2o的混合液，在42℃反应1h，70℃下15min反应结束。

pcr反应体系：pcr扩增试剂盒为2×estaqmastermix，反应体系的总体积为10μl，含5μl2×estaqmastermix，1μlcdna模板，0.2-0.4μl烟草花叶病毒属通用引物正向引物，0.2-0.4μl烟草花叶病毒属通用引物反向引物，3.2-3.6μlddh2o。反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，45-55℃退火30s，72℃延伸0.5-1min，循环30-35次；72℃延伸5-10min；4℃终止反应。反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察结果。结果表明，分别以上述5种以侵染茄科作物为主的tmv、tomv、tommv、tmgmv、pmmov及1种侵染兰科的orsv和1种侵染葫芦科的cgmmv为模板，并以tobamodf/tobamodr为通用引物，经rt-pcr检测，均能扩增出大小约为880bp的单一条带，pcr产物经克隆测序后均表明所获得的序列与相应病毒同源性最高且不存在交叉反应。

本发明中的检测引物是基于烟草花叶病毒属中32种病毒基因组核苷酸的保守区序列进行设计，用该属中的7种病毒对该对引物进行扩增效果验证，扩增效果均较好；从而建立了一种能够检测至少7种烟草花叶病毒属病毒的通用检测引物及方法，且具有检测效率高、灵敏度高、成本低的特点。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。