一种构建竹类植物遗传图谱的方法与流程

文档序号:12412837阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种构建竹类植物遗传图谱的方法,其特征在于,该方法包括下述步骤:

第1步、亲本植株的培养:搜集单株将要开花或已经开花的竹子个体移栽作为待用亲本;

第2步、亲本植株的自交:去除成熟雌蕊,搜集亲本的成熟花粉,将其涂抹在刚露出的雌蕊上;

第3步、自交一代种子的采集,萌发与培养:采集亲本产生的F1代种子,萌发小苗并培养得到120-200株10-30cm高的小苗;

第4步、亲本与子代基因组DNA的提取:利用改良CTAB法提取基因组DNA,基因组DNA经过琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测完整度及纯度,并稀释成50ng/μl;

第5步、简化基因组文库的构建与测序:使用ddRAD进行简化基因组文库构建并采用二代测序平台上机测序;

第6步、基因分型:使用TASSEL,Stacks软件进行数据处理,得到基因分型矩阵;

第7步、应用模拟F2代群体策略进行图谱构建:使用Joinmap 4.0的F2模型或CP模型进行连锁相区分及图谱分群和排序,之后使用Mapchart软件进行图谱展示。

2.根据权利要求1所述的一种构建竹类植物遗传图谱的方法,其特征在于,其中第5步所述的简化基因组文库的构建方法为RAD,ddRAD,2b-RAD,ezRAD,RRL,GBS和双酶切GBS。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,其中第5步所述的二代测序平台为Illumina Hiseq2000、Hiseq2500、Hiseq4000、Hiseq X10、Hiseq X5或Miseq。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种构建竹类植物遗传图谱的方法,其特征在于,该方法包括下述步骤:

第1步、亲本植株的搜集:

针对丛生竹竹种,直接从野外搜集单株将要开花或在初花期的竹子个体作为待用亲本移栽;针对散生竹竹种,由于它们一般成片分布,不易推断其来源,待发现将要开花或在初花期的竹子群体后,需要挖开地下竹鞭检查其是否连在一起,竹鞭相连的个体整体移栽作为待用亲本;

第2步、亲本植株的自交:

首先,去除已经授过粉的雌蕊或已经开始发育的种子,然后,搜集亲本的成熟花粉于培养皿中,用毛刷蘸取花粉,将其涂于刚露出的柱头上,完成授粉;

第3步、自交一代种子的采集,萌发与培养:

完成授粉后,种子开始发育,经过40-70天种子逐渐发育成熟,采集亲本产生的F1代饱满种子置于1/4MS培养基上萌发,3-7天后将小苗移栽到泥炭∶珍珠岩=1:1的基质上于温室培养炼苗,30天后将小苗移栽到田间并培养,直至得到15-30cm高的小苗;

第4步、亲本与子代基因组DNA的提取:

采用改良CTAB法分别提取竹子亲本与子代的幼嫩叶片全基因组DNA:

(1)取200ml 2%CTAB 60℃预热,加入2‰二硫苏糖醇后混匀,

(2)称取80mg新鲜幼嫩叶片,加液氮快速研磨成粉末状,转入盛有1ml 55-60℃CTAB缓冲液的2ml小离心管,振荡混匀,60℃水浴,55min,期间混匀数次,

(3)取出离心管冷却2min,加入约1ml氯仿-异戊醇(比例24:1),充分摇晃混匀,之后在室温下10,000rpm离心5min,

(4)取上一步得到的上清液,转移至另一2ml离心管中,加入700μl氯仿-异戊醇,比例24:1,颠倒混匀3-5min,室温下10,000rpm离心5min,

(5)取离心液上清,转移至另一新1.5ml离心管,加600μl异丙醇,-20℃下沉降DNA半个小时,

(6)室温下10,000rpm离心上述离心管5min,弃去上清,保留底部沉淀,

(7)室温下使用1ml无水乙醇洗涤沉淀两次,10,000rpm离心5min,弃上清液,吹干无水乙醇15min,

(8)加60-80μl TE缓冲液或无菌水充分溶解,然后加2μl RNase,37℃消化30min即完成DNA提取;

DNA提取完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整程度,然后,利用NanoDrop ND1000测定DNA的浓度,稀释至50ng/μl备用;

第5步、简化基因组文库的构建与测序:

(1)基因组DNA的酶切:利用AvaII,10,000U/ml,NEB和MspI,10,000U/ml,NEB对竹子基因组DNA进行酶切消化;AvaII和MspI缓冲液成分为:50mMKAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)2、100μg/ml BSA,该缓冲液的pH7.9;酶切反应条件为:37℃水浴4h;65℃失活20min;4℃保存酶切产物;

(2)使用T4 DNA连接酶,400,000U/ml,NEB对上述酶切产物连接上P1接头和P2接头,得到含有“P1接头-DNA插入片段-P2接头”的序列对;其中T4 DNA连接酶匹配的缓冲液成分为50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10mM DDT、1mM ATP;连接反应条件为:23℃连接2h;65℃失活20min;4℃保存连接产物;

(3)将来自不同竹子个体的“P1接头-DNA-P2接头”的序列对按1:1的体积比进行混合;

(4)将混合物经琼脂糖凝胶电泳回收得到目标DNA片段;琼脂糖凝胶浓度为2.0%,电泳缓冲液为新配制的1XTAE,电泳电压为4V/cm,电泳时间为90min。切胶范围为600-700bp;

(5)以回收的DNA片段作为模板进行PCR扩增以富集目标DNA片段并对PCR产物进行纯化;PCR反应条件为:98℃预变性3min;后进入循环程序:98℃变性20s、62℃退火30s、72℃延伸30s,共计18-20个循环;72℃延伸15min,4℃保存备用,柱式纯化使用的是E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit所提供的离心柱;

(6)对扩增后的PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行片段分布检查;琼脂糖凝胶浓度为2.0%,电泳电压为8V/cm,电泳时间为30min;

(7)使用RT-PCR定量并使用二代测序平台Illumina Hiseq2500、Hiseq4000、Hiseq X10或Miseq上机测序;

第6步、基因分型:

首先,使用TASSEL或Stacks软件进行数据过滤,保留高质量的数据,质量值大于30;然后,分别对亲本和子代进行聚类,得到一个个序列段tag;最后,通过子代和亲本序列的比对得到亲本中杂合的序列段,这些序列段作为候选的标记,将每个个体的这些序列段整理得到h-k基因分型矩阵;

第7步、应用模拟F2群体策略进行图谱构建:

将h-k基因分型矩阵导入Joinmap 4.0软件,使用卡方检验每个标记的分离比是否符合1:2:1的孟德尔分离比,将符合分离比例的标记使用Joinmap 4.0的CP模型进行连锁相区分,并将h-k基因分型矩阵转换为F2群体模型分析所需的A-B基因分型矩阵,将矩阵导入遗传图谱构建软件如JoinMap 4.0、QTL IciMapping等进行图谱分群和排序,之后使用Mapchart软件进行图谱展示,完成图谱构建。

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