一种构建竹类植物遗传图谱的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及到竹类植物高密度遗传连锁图谱的快速构建方法，是一种基于自交一代分离群体的竹子遗传图谱快速构建方法。

背景技术：

竹类植物属于禾本科竹亚科(Bambusoideae)，大部分为木质化禾草。全世界约有88属1400余种,主要分布在亚洲、非洲和美洲的热带以及亚热带区域(Li等，2006)。中国是世界上木本竹最具多样性的地区,约有37属500余种。目前全球共有竹林面积2200万hm²,约占世界森林总面积的1％。其中中国是竹林面积最大的国家，面积约为379万hm²,被誉为“竹子王国”。从我国竹子的地带性分布看,大致可分为4个竹区:北亚热带竹区，中亚热带竹区，南亚热带竹区，西南高山竹区(邱尔发等，2001)。作为禾本科植物重要物种之一,竹子具有广泛的生态和经济效益。首先，由于竹子分布范围广,生态类型复杂，它对维持生态平衡和群落结构稳定具有重要的作用；其次，由于竹子具有生长快、成材周期短、一次成林多次利用的特点，竹子已被加工成多种初级及次级工业产品,譬如竹筷，竹椅，木地板、竹炭纤维、竹叶黄酮及竹笋制品等；此外，竹子也是国宝大熊猫等野生动物的主食。

虽然竹子在国民经济生活中具有十分重要的价值，但其在分子遗传尤其是育种领域的研究基础相对薄弱。这固然与竹子种质资源的保存和利用起步较晚有关，但更多的是由于竹子复杂而独特的开花机制导致的。不同竹种开花周期不同,同一竹种在不同种植地的开花周期也不是固定不变的。杜凡等研究人员(2000年)15年来在云南观察结果发现竹子的开花结实现象比较复杂，可以分为全体成片开花、零星开花；开花致死、开花不死、开花致死与开花不死并存；开花后结实、开花后不结实等多种复杂类型。总体来说,竹子是多年生一次开花的植物。一般认为其开花周期为3-120年,有的甚至长达200多年(Janzen等，1976)。竹子试管开花诱导虽然已有成功的报道,但其机理仍不清楚。自然条件下和实验室内无法建立稳定的繁育体系并获得种子是竹子进行杂交育种并改良竹种的一大障碍。

遗传图谱的构建具有重要的理论和应用价值，是对基因组进行全面研究的基础。利用分子标记和特定的遗传群体构建竹种的基因连锁图谱,寻找与竹子特定经济性状紧密连锁的分子标记以及利用分子标记进行辅助选择育种是对竹子进行遗传改良的基础。目前禾本科植物已经有数十种重要作物构建了高密度遗传图谱,如水稻、玉米、高粱和小麦等,并在其遗传育种等方面发挥着重要作用。进行遗传图谱构建时首先要选择合适的作图群体，由于农作物如水稻，玉米等一年即开花结实，育种周期短，构建作图群体相对容易，已培育出较多的高世代自交群体(RIL)与回交群体(NIL)。而竹类植物由于开花周期不确定，所以要像作物那样建立自交系或高世代群体用于图谱构建则需要几十到几百年的时间。因而必须寻求新的遗传作图群体。中国林业科学研究院袁金玲等(2005年)尝试利用人工控制授粉获得麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)F1代群体并用“拟测交”策略构建麻竹遗传图谱，但只收集得到44株F1代个体。经过RAPD标记扩增分型与连锁分析,最后只形成7条连锁群，与麻竹的36条连锁群相距甚远，而且上图标记仅有46个RAPD位点，远达不到对性状进行定位的要求。因此使用传统的低世代(F1代)杂交群体也难以获得一张完整的竹类遗传图谱，这严重限制了竹类植物的遗传育种工作的开展，如经济性状与标记间的连锁分析、基因定位以及分子标记辅助选择育种等。因此探索利用新型的低世代群体以及高密度的分子标记,进行竹类遗传图谱的构建是克服现有技术方法不足的有效途径。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种构建竹类植物遗传图谱的方法，该方法利用竹类的自交一代群体为遗传作图材料，并采取模拟F2代群体策略以及简化基因组测序分型技术来快速构建竹子的遗传图谱，使竹子的遗传图谱构建在短时间内得以实现，为其遗传改良提供新的思路和方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案加以实现的：

一种构建竹类植物遗传图谱的方法，该方法包括下述步骤：

第1步、亲本植株的培养：搜集单株将要开花或已经开花的竹子个体移栽作为待用亲本；

第2步、亲本植株的自交：去除成熟雌蕊，搜集亲本的成熟花粉，将其涂抹在刚露出的雌蕊上；

第3步、自交一代种子的采集，萌发与培养：采集亲本产生的F1代种子，萌发小苗并培养得到120-200株10-30cm高的小苗；

第4步、亲本与子代基因组DNA的提取：利用改良CTAB法提取基因组DNA，基因组DNA经过琼脂糖凝胶电泳及分光光度计检测完整度及纯度，并稀释成50ng/μl；

第5步、简化基因组文库的构建与测序：使用ddRAD进行简化基因组文库构建并采用二代测序平台上机测序；

第6步、基因分型：使用TASSEL，Stacks软件进行数据处理，得到基因分型矩阵；

第7步、应用模拟F2代群体策略进行图谱构建：使用Joinmap 4.0的F2模型或CP模型进行连锁相区分及图谱分群和排序，之后使用Mapchart软件进行图谱展示。

根据所述的一种构建竹类植物遗传图谱的方法，其中第5步所述的简化基因组文库的构建方法为RAD，ddRAD，2b-RAD，ezRAD，RRL，GBS和双酶切GBS。

根据所述的方法，其中第5步所述的二代测序平台为Illumina Hiseq2000、Hiseq2500、Hiseq4000、Hiseq X10、Hiseq X5或Miseq。

根据所述的一种构建竹类植物遗传图谱的方法，该方法包括下述步骤：

第1步、亲本植株的搜集：

针对丛生竹竹种，直接从野外搜集单株将要开花或在初花期的竹子个体作为待用亲本移栽；针对散生竹竹种，由于它们一般成片分布，不易推断其来源，待发现将要开花或在初花期的竹子群体后，需要挖开地下竹鞭检查其是否连在一起，竹鞭相连的个体整体移栽作为待用亲本；

第2步、亲本植株的自交：

首先，去除已经授过粉的雌蕊或已经开始发育的种子，然后，搜集亲本的成熟花粉于培养皿中，用毛刷蘸取花粉，将其涂于刚露出的柱头上，完成授粉；

第3步、自交一代种子的采集，萌发与培养：

完成授粉后，种子开始发育，经过40-70天种子逐渐发育成熟，采集亲本产生的F1代饱满种子置于1/4MS培养基上萌发，3-7天后将小苗移栽到泥炭∶珍珠岩＝1:1的基质上于温室培养炼苗，30天后将小苗移栽到田间并培养，直至得到15-30cm高的小苗；

第4步、亲本与子代基因组DNA的提取：

采用改良CTAB法分别提取竹子亲本与子代的幼嫩叶片全基因组DNA：

(1)取200ml 2％CTAB 60℃预热，加入2‰二硫苏糖醇后混匀，

(2)称取80mg新鲜幼嫩叶片，加液氮快速研磨成粉末状，转入盛有1ml 55-60℃CTAB缓冲液的2ml小离心管，振荡混匀，60℃水浴，55min，期间混匀数次，

(3)取出离心管冷却2min，加入约1ml氯仿-异戊醇(比例24:1)，充分摇晃混匀，之后在室温下10,000rpm离心5min，

(4)取上一步得到的上清液，转移至另一2ml离心管中，加入700μl氯仿-异戊醇，比例24:1，颠倒混匀3-5min，室温下10,000rpm离心5min，

(5)取离心液上清，转移至另一新1.5ml离心管，加600μl异丙醇，-20℃下沉降DNA半个小时，

(6)室温下10,000rpm离心上述离心管5min，弃去上清，保留底部沉淀，

(7)室温下使用1ml无水乙醇洗涤沉淀两次，10,000rpm离心5min，弃上清液，吹干无水乙醇15min，

(8)加60-80μl TE缓冲液或无菌水充分溶解，然后加2μl RNase，37℃消化30min即完成DNA提取；

DNA提取完成后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整程度，然后，利用NanoDrop ND1000测定DNA的浓度，稀释至50ng/μl备用；

第5步、简化基因组文库的构建与测序：

(1)基因组DNA的酶切：利用AvaII，10,000U/ml，NEB和MspI，10,000U/ml，NEB对竹子基因组DNA进行酶切消化；AvaII和MspI缓冲液成分为：50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)₂、100μg/ml BSA，该缓冲液的pH7.9；酶切反应条件为：37℃水浴4h；65℃失活20min；4℃保存酶切产物；

(2)使用T4DNA连接酶，400,000U/ml，NEB对上述酶切产物连接上P1接头和P2接头，得到含有“P1接头-DNA插入片段-P2接头”的序列对；其中T4DNA连接酶匹配的缓冲液成分为50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM DDT、1mM ATP；连接反应条件为：23℃连接2h；65℃失活20min；4℃保存连接产物；

(3)将来自不同竹子个体的“P1接头-DNA-P2接头”的序列对按1:1的体积比进行混合；

(4)将混合物经琼脂糖凝胶电泳回收得到目标DNA片段；琼脂糖凝胶浓度为2.0％，电泳缓冲液为新配制的1XTAE，电泳电压为4V/cm，电泳时间为90min。切胶范围为600-700bp；

(5)以回收的DNA片段作为模板进行PCR扩增以富集目标DNA片段并对PCR产物进行纯化；PCR反应条件为：98℃预变性3min；后进入循环程序：98℃变性20s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共计18-20个循环；72℃延伸15min，4℃保存备用，柱式纯化使用的是E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit所提供的离心柱；

(6)对扩增后的PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行片段分布检查；琼脂糖凝胶浓度为2.0％，电泳电压为8V/cm，电泳时间为30min；

(7)使用RT-PCR定量并使用二代测序平台Illumina Hiseq2500、Hiseq4000、Hiseq X10或Miseq上机测序；

第6步、基因分型：

首先，使用TASSEL或Stacks软件进行数据过滤，保留高质量的数据，质量值大于30；然后，分别对亲本和子代进行聚类，得到一个个序列段tag；最后，通过子代和亲本序列的比对得到亲本中杂合的序列段，这些序列段作为候选的标记，将每个个体的这些序列段整理得到h-k基因分型矩阵；

第7步、应用模拟F2群体策略进行图谱构建：

将h-k基因分型矩阵导入Joinmap 4.0软件，使用卡方检验每个标记的分离比是否符合1:2:1的孟德尔分离比，将符合分离比例的标记使用Joinmap 4.0的CP模型进行连锁相区分，并将h-k基因分型矩阵转换为F2群体模型分析所需的A-B基因分型矩阵，将矩阵导入遗传图谱构建软件如JoinMap 4.0、QTL IciMapping等进行图谱分群和排序，之后使用Mapchart软件进行图谱展示，完成图谱构建。

本发明首次使用了自然条件下单株开花的个体作为亲本对竹子开展遗传图谱的构建，克服了竹子杂交困难的障碍，减少了杂交材料搜集和培养的工作量和时间，简化了遗传图谱构建流程。同时采用自交的方式，避免了杂交去雄不彻底所导致的子代材料污染。此外，以S1为作图群体来模拟F2群体进行作图，与现有多种构图软件相兼容性良好。最后，该方法使用新一代简化基因组测序技术对亲本及子代进行分型，降低了基因分型成本和时间。从群体构建到完成作图，该流程仅使用6个月的时间。该方法特别适用于丛生及散生竹类植物遗传图谱的构建及QTL定位。因而该方法未来在竹子分子育种领域具有良好的应用前景。

与传统林木中已利用拟测交策略(Grattapaglia等，1994)来进行图谱构建工作的方法相比，本发明的方法主要特点是：1、该方法仅仅使用单株自然开花的个体作为亲本，而不需要同时培养两个来源不同的品系，减少了材料搜集和培养所需的人力和时间成本；2、该方法采用自交的方式，避免了杂交去雄不彻底所导致的子代材料污染；3、该方法以高度杂合的亲本自交所得的S1为作图群体来模拟F1自交产生的F2群体进行作图，而不是传统拟测交策略所模拟的回交(BC1)群体，与现有构图软件相兼容性良好；4、该方法使用新一代简化基因组测序技术对亲本及子代进行分型，而不是传统依赖PCR等技术的分子标记分型技术，降低了基因分型成本和时间。由于该方法思路简洁，实验步骤较少，该流程允许仅使用6个月的时间即可完成竹子遗传图谱的构建。

附图说明

图1为麻竹亲本植株开花状态下的成熟雄蕊；

图2为麻竹亲本自交一代种子萌发出来的小苗；

图3为采用本方法构建得到的竹子遗传图谱LGl-LG36号连锁群。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来对本发明做进一步详细说明，但并不以此为限。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

麻竹自交一代遗传群体的构建：

本实施例选择广泛分布于中国南方各省的麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)为实验材料，麻竹遗传作图群体的构建包括如下步骤：

第1步、麻竹亲本植株的搜集：

麻竹是一种丛生竹竹种，生长于一丛的数根竹竿由一个母株繁殖而来。我们在云南省弥勒市发现一丛在初花期的麻竹个体并将其作为待用亲本，移栽至中国科学院昆明植物研究所内温室区。

第2步、麻竹亲本植株的自交：

首先，用剪刀剪去已经开始授过粉发育的种子和已经露出的雌蕊(授粉状况不明)，仅保留雄蕊和未发出的雌蕊；然后，在上午8-11时搜集亲本的成熟花粉于培养皿中，用毛刷蘸取花粉(成熟雄蕊见图1)，将其涂于刚露出的柱头上，完成授粉，并作套袋处理；

第3步、自交一代种子的采集，萌发与培养：

完成授粉后，种子开始发育，经过约40-80天种子逐渐发育成熟，采集亲本产生的F1代饱满种子600颗，播至1/4MS培养基上萌发。7天后将小苗移栽到泥炭：珍珠岩＝1:1的基质上于温室培养，2-3天喷洒1/8MS营养液一次。30天后将存活小苗500棵移栽到田间并培养直至得到约15-30cm高的小苗(见图2)；

实施例2

构建麻竹遗传图谱：

第1步、亲本与子代基因组DNA的提取：

从实施例1获得的Sl群体中随机选取188棵子代个体用于麻竹遗传图谱构建。采用改良CTAB法分别提取麻竹亲本与子代的幼嫩叶片全基因组DNA：

(1)取200ml 2％CTAB 60℃预热，加入2‰二硫苏糖醇后混匀，

(2)称取80mg新鲜幼嫩叶片，加液氮快速研磨成粉末状，转入盛有1ml 60℃CTAB缓冲液的2ml小离心管，振荡混匀，60℃水浴，50min，期间混匀数次，

(3)取出离心管冷却2min，加入1ml体积比为24:1的氯仿-异戊醇，上下颠倒以充分混匀，之后室温下10,000rpm离心5min，

(4)取离心液上清，转移至一新2ml离心管，沿管壁轻轻加入700μl氯仿-异戊醇(体积比24:1)，上下颠倒3-5min混匀，室温下10,000rpm离心5min，

(5)取离心液上清，转移至一1.5ml离心管，加600μl冷藏异丙醇，-20℃下沉降DNA 30min，

(6)室温下10,000rpm离心上述离心管5min，弃去上清，保留白色沉淀，

(7)室温下使用1ml无水乙醇洗涤白色沉淀两次，10,000rpm离心5min，弃上清，烘干15min，使无水乙醇挥发干净，

(8)加60μl TE缓冲液充分溶解，加2μl RNase，37℃消化30min即完成DNA提取；

DNA提取完成后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整程度，然后，利用NanoDrop ND1000测定DNA的浓度，稀释至50ng/μl备用；

第2步、简化基因组文库的构建与测序：

简化基因组文库的构建使用一种改进的双酶切简化基因组文库(MiddRAD)构建方法：

(1)基因组DNA的酶切：利用AvaII(10,000U/ml，NEB)和MspI(10,000U/ml，NEB)对竹子基因组DNA进行酶切消化；AvaII和MspI消化反应体系为：基因组DNA 4.0μl，AvaII 0.8μl，MspI 0.4μl，Buffer 4.0μl，ddH₂O 30.8μl；AvaII和MspI缓冲液成分为：50mM KAc、20mM Tris-Ac、10mM Mg(Ac)₂、100μg/ml BSA，该缓冲液的pH7.9；酶切反应条件为：37℃水浴4h；65℃失活20min；4℃保存酶切产物。

(2)使用T4DNA连接酶(400,000U/ml，NEB)对上述酶切产物连接上P1接头和P2接头，得到含有“P1接头-DNA插入片段-P2接头”的序列对连接体系为：酶切产物40.0μl，P1接头1.0μl，P2接头4.0μl，10XT4连接酶缓冲液4.0μl，T4DNA连接酶0.5μl，ddH₂O 0.5μl；其中T4DNA连接酶匹配的缓冲液成分为50mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、10mM DDT、1mM ATP；连接反应条件为：23℃连接2h；65℃失活20min；4℃保存连接产物。

(3)将来自不同竹子个体的“P1接头-DNA-P2接头”的序列对按1:1的体积比进行混合；

(4)将混合物经琼脂糖凝胶电泳回收得到目标DNA片段；琼脂糖凝胶浓度为2.0％，电泳缓冲液为新配制的1XTAE，电泳电压为4V/cm，电泳时间为90min。切胶范围为600-700bp。

(5)以回收的DNA片段作为模板进行PCR扩增以富集目标DNA片段并对PCR产物进行纯化；PCR扩增体系为：基因组DNA 20.0μl，PCR phusion mix 25.0μl，引物1

1.0μl，引物2 1.0μl，ddH₂0 3.0μl PCR；反应条件为：98℃预变性3min；后进入循环程序：98℃变性20s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共计18个循环；72℃延伸15min，4℃保存备用。纯化使用的是E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit所提供的离心柱。

(6)对扩增后的PCR产物使用琼脂糖凝胶电泳进行片段分布检查；琼脂糖凝胶浓度为2.0％，电泳电压为8V/cm，电泳时间为30min。

(7)使用RT-PCR定量并使用二代测序平台Illumina Hiseq X10上机测序，测序长度为PE150bp。

第3步、基因分型：

首先，使用Stacks软件process rad tags程序进行数据过滤，保留高质量的数据(质量值大于30)，每个个体得到约2Gb高质量数据；然后，使用ustacks及cstacks程序分别对亲本和子代进行聚类(主要参数：-m10，-M3)，平均每个个体得到100，000个序列段(tag)，tag平均深度约为30X；最后，通过子代和亲本序列的比对得到亲本中杂合的序列段，这些序列段作为候选的标记，通过genotype程序将每个个体的这些序列段整理得到含有3，258个位点的h-k基因分型矩阵；

第4步、应用模拟F2群体策略进行图谱构建：

将h-k基因分型矩阵导入Joinmap 4.0软件，使用卡方检验每个标记的分离比是否符合1:2:1的孟德尔分离比(p<0.05)，将符合分离比例的标记使用Joinmap 4.0的CP及F2模式进行连锁相区分及图谱分群和排序。最后将以上得到2，367个SNP标记位点输入作图软件JoinMap 4.0进行图谱的构建，设置LOD＝10,共2，365个SNP标记上图，获得了36条麻竹连锁群，总图距为2733.59cM，平均图距1.56cM(见表1)，图谱使用Mapchart软件进行展示(见图3)。

从以上实施例可以看出，使用S1群体可以快速构建竹子高密度遗传图谱，该技术在农业分子育种领域将具有良好的应用价值和推广前景。

表1麻竹遗传图谱36条连锁群标记统计表