一种基于耐热核酸酶HII的单核苷酸多态性检测方法与流程

本发明涉及一种基于耐热核酸酶HII的单核苷酸多态性检测方法，属于核酸检测和基因分型技术领域。

背景技术：

核酸检测和SNP分析已经是一个很大的产业。这些技术不仅在科学研究上获得广泛的应用，在临床诊断、食品检测、法医鉴定等领域的重要性也越来越明显。现今的核酸检测和SNP分析技术种类多样，其基本核心是核酸杂交检测技术、核酸序列分析技术和聚合酶链式反应(PCR)。检测通量与灵敏度高，以及操作简单、检测时间短是基因和SNP检测的发展方向。

分子信标(molecular beacon)为DNA的恒温检测提供了可能，已成功用于检测多种致病微生物。分子信标是一种短的寡核苷酸单链构成的茎环结构。分子信标一端为荧光基团标记，另一端为淬灭基团标记。由于两端的核苷酸序列互补，其荧光基团和淬灭基团相互靠近发生能量共振，被激发后荧光基团产生的光子被淬灭基团淬灭。如果被检测的核酸分子能够与分子信标的单链环区域杂交，分子信标的茎结构遭到破坏，增加了荧光基团与淬灭基团之间的空间距离，不能产生荧光能量共振转移，就能够检测被激发后荧光基团产生的荧光信号。但是在整个检测过程中，荧光信号的强弱依赖于被检测的DNA分子的含量，不存在信号放大，因此直接用分子信标杂交目标核酸的检测技术，其灵敏度不理想。

RNase HII是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。J.Rizzo等人在2002年首次运用分子信标方法来检测核糖核酸酶动力学和酶切机制[Molecular and Cellular Probes,2002,16:277–283]。但是目前为止未见关于核糖核酸酶HII结合分子信标来检测核酸分子的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对分子信标检测技术的不足，提供一种新的基于耐热核酸酶HII的单核苷酸多态性检测方法。本发明方法与传统分子信标检测技术相比，可以检测双链核酸并放大检测信号，其主要通过耐热核酸酶HII将中间带有一个核糖核苷酸的分子信标在中间切断，将荧光信号累积下来，达到信号放大的作用。该方法可以用于核酸检测和基因分型测定。与荧光定量PCR仪结合在一起，可以实现在线高通量检测。本专利可以进行食品污染微生物、环境微生物、病原微生物等的分子检测，重要遗传病的分子检测诊断，以及HLA基因分型等。

为实现这样的目的，在本发明中，分子信标中间位置为一个核糖核苷酸，同时采用耐热核酸酶HII，可以在热循环仪中检测双链DNA样本。本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种基于耐热核酸酶HII的单核苷酸多态性检测方法，具体步骤如下：

第一步，制备中间带一个核糖核苷酸的分子信标；

制备的分子信标的中间带一个核糖核苷酸，中间的核苷酸和检测样本DNA配对，两侧的6个核苷酸彼此配对，两侧分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，整个分子信标形成茎环结构；

第二步，检测反应体系的建立

将扩增检测样本DNA的引物序列、dNTP、Taq DNA聚合酶，Tth核酸酶HII、中间带一个核糖核苷酸的分子信标、检测样本DNA加入Taq酶催化的反应体系中，配制反应混合物；

第三步，荧光信号放大反应

将第二步中的反应混合物，放入荧光定量PCR仪中，定量荧光信号，进行PCR扩增和基因分型检测；

第四步，确定基因多态性

根据不同样本间荧光信号的差异，确定检测样本待测位点的单核苷酸多态性。

上述第一步中，荧光发射基团为FAM或者TET；荧光淬灭基团为DACBYL或BHQ。

上述第一步中，制备的分子信标长31-41个核苷酸。优选的，分子信标长33-35个核苷酸。

上述第二步中，核酸酶HII为Tth核酸酶HII、Ape核酸酶HII、Pfu核酸酶HII等耐高温型核酸酶HII中任一种。

本发明与现有的基因分子信标的核酸检测和基因分型技术相比有显著的进步。主要优点如下：(1)分子信标中间带有一个核糖核苷酸，可以切断分子信标，放大荧光信号。(2)核酸酶HII来源于耐热微生物，因此检测反应可以在高温下以热循环的形式进行，可以有效的检测双链DNA样本。(3)检测反应与核算扩增反应耦合在一起，提高了检测灵敏度。

附图说明

图1为基于耐热核酸酶HII的单核苷酸多态性检测技术原理图。

图2是本发明实施例1的氨苄青霉素抗性基因432位碱基多态性检测结果示意图。

图3是本发明实施例2的大肠杆菌DNA聚合酶I 260位碱基多态性检测结果示意图。

图4是本发明实施例3的大肠杆菌DNA聚合酶IV 300位碱基多态性检测结果示意图。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

本发明的基于耐热核酸酶HII的单核苷酸多态性检测技术原理图如图1所示，首先设计合成中间带有一个核糖核苷酸的分子信标，利用耐热的核酸酶HII，在反应体系中加入、测定样本DNA、PCR组分、分子信标和核酸酶HII，在荧光定量PCR仪中进行检测，确定样本的单核苷酸多态性。具体如下

第一步；PCR扩增待检目标核酸区；

第二步，分子信标与目标核酸杂交配对形成双链配对区，热稳定性核糖核酸酶HII在核糖核苷酸处切断分子信标，分子信标释放出荧光信号；

第三步，断裂的分子信标3’端半分子从单链DNA模板上解离下来，游离的单链DNA模板可以指导下一轮的分子信标酶切反应(荧光信号放大环路1)；同时，断裂的分子信标5’端半分子的3’端为自由羟基，与单链DNA模板结合的半分子可以延伸成带3’长末端的双链DNA，下一轮PCR后生成短的平末端双链DNA，这两条双链DNA均可以指导下一轮的分子信标酶切反应(荧光信号放大环路2)。

若分子信标的核糖核苷酸与目标核酸的对应碱基形成错配碱基对，则热稳定性核糖核酸酶HII切断分子信标的能力大大减低，最终结果是只有极少量的分子信标被切断，与正确配对的分子信标相比此时释放出的荧光信号极弱，因此可以通过释放的荧光信号强度差异来确定SNP种类。

实施例1

针对氨苄抗性基因，利用设计的核糖核苷酸分子信标和Tth的核酸酶HII，进行氨苄抗性基因多态性分型检测，检测位置为氨苄抗性基因420位碱基的种类，具体实施步骤如下：

第一步，制备中间带一个核糖核苷酸的分子信标。分子信标长33个核苷酸，中间带有一个核糖核苷酸，中间的21个核苷酸与氨苄抗性基因DNA的410-430位核苷酸配对，两侧的6个核苷酸彼此配对，两侧分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，整个分子信标形成茎环结构，无荧光释放出来。ru尿嘧啶核苷酸、ra腺嘌呤核苷酸、rc胞嘧啶核苷酸和rg鸟嘌呤核苷酸；4条分子信标如下：

Amp-T：5’FAM-CGCGCCTGACAACGATraGGAGGACCGAGGCGCG-DABCYL

Amp-A：5’FAM-CGCGCCTGACAACGATruGGAGGACCGAGGCGCG-DABCYL

Amp-C：5’FAM-CGCGCCTGACAACGATrcGGAGGACCGAGGCGCG-DABCYL

Amp-G：5’FAM-CGCGCCTGACAACGATrgGGAGGACCGAGGCGCG-DABCYL

第二步，检测反应体系的建立。涉及合成扩增氨苄抗性基因的引物序列，并将dNTP、Taq DNA聚合酶，Tth核酸酶HII、1种分子信标、DNA样本加入Taq酶催化的反应体系中，配制反应混合物。4条分子信标分别加入含有检测样本DNA的反应体系，一个样本对应4个分子信标的检测反应。引物序列如下：

Amp-F:5’atgagtattc aacatttccg t

Amp-R:5’cgtcaatacg ggataatacc

第三步，荧光信号放大反应。将第二步中的针对检测样本的4个反应混合物，放入荧光定量PCR仪中，进行PCR扩增和基因分型检测。

第四步，确定基因多态性。定量4个检测反应的荧光信号(图2)，根据4个反应体系和分子信标的序列特异性，由于分子信标rg的产生的荧光信号最高，因此确定检测样本氨苄青霉素抗性基因待测位点的单核苷酸多态性为碱基C。

实施例2

针对大肠杆菌DNA聚合酶I基因，利用设计的核糖核苷酸分子信标和Ape的核酸酶HII，进行基因多态性分型检测，检测位置为DNA聚合酶基因260位碱基的种类，具体实施步骤如下：

第一步，制备中间带一个核糖核苷酸的分子信标。分子信标长33个核苷酸，中间带有一个核糖核苷酸，中间的21个核苷酸与DNA聚合酶I基因的250-270位核苷酸配对，两侧的6个核苷酸彼此配对，两侧分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，整个分子信标形成茎环结构，无荧光释放出来。ru尿嘧啶核苷酸、ra腺嘌呤核苷酸、rc胞嘧啶核苷酸和rg鸟嘌呤；核苷酸4条分子信标如下：

Amp-T：5’FAM-CGCGCCTGCACGCAGAraCGTCCGGCATGGCGCG-DABCYL

Amp-A：5’FAM-CGCGCCTGCACGCAGAruCGTCCGGCATGGCGCG-DABCYL

Amp-C：5’FAM-CGCGCCTGCACGCAGArcCGTCCGGCATGGCGCG-DABCYL

Amp-G：5’FAM-CGCGCCTGCACGCAGArgCGTCCGGCATGGCGCG-DABCYL

第二步，检测反应体系的建立。涉及合成扩增氨苄抗性基因的引物序列，并将dNTP、Taq DNA聚合酶，Ape核酸酶HII、1种分子信标、大肠杆菌DNA样本加入反应体系中，配制反应混合物。4条分子信标分别加入含有检测样本DNA的反应体系，进行4个分子信标检测反应。扩增大肠杆菌DNA聚合酶I的引物序列如下：

polI-F:5’atggttcagatcccccaaaat

polI-R:5’tttcaccgacgcccggtacg

第三步，荧光信号放大反应。将第二步中的针对检测样本的4个反应混合物，放入荧光定量PCR仪中，进行PCR扩增和基因分型检测。

第四步，确定基因多态性。定量4个检测反应的荧光信号(图3)，根据4个反应体系和分子信标的序列特异性，结果显示分子信标ru的荧光信号最高，因此确定检测样本大肠杆菌DNA聚合酶I待测位点的单核苷酸多态性为碱基A。

实施例3

针对大肠杆菌DNA聚合酶IV基因，利用设计的核糖核苷酸分子信标和Pfu的核酸酶HII，进行基因多态性分型检测，检测位置为DNA聚合酶基因300位碱基的种类，具体实施步骤如下：

第一步，制备中间带一个核糖核苷酸的分子信标。分子信标长33个核苷酸，中间带有一个核糖核苷酸，中间的21个核苷酸与DNA聚合酶IV基因的290-310位核苷酸配对，两侧的6个核苷酸彼此配对，两侧分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，整个分子信标形成茎环结构，无荧光释放出来。ru尿嘧啶核苷酸、ra腺嘌呤核苷酸、rc胞嘧啶核苷酸和rg鸟嘌呤核苷酸；4条分子信标如下：

Amp-T：5’FAM-CGCGCCCATCCAGTGAraAACGGTTCAAGGCGCG-DABCYL

Amp-A：5’FAM-CGCGCCCATCCAGTGAruAACGGTTCAAGGCGCG-DABCYL

Amp-C：5’FAM-CGCGCCCATCCAGTGArcAACGGTTCAAGGCGCG-DABCYL

Amp-G：5’FAM-CGCGCCCATCCAGTGArgAACGGTTCAAGGCGCG-DABCYL

第二步，检测反应体系的建立。涉及合成扩增氨苄抗性基因的引物序列，并将dNTP、Taq DNA聚合酶，Pfu核酸酶HII、1种分子信标、大肠杆菌DNA样本加入反应体系中，配制反应混合物。4条分子信标分别加入含有检测样本DNA的反应体系，进行4个分子信标检测反应。扩增大肠杆菌DNA聚合酶IV的引物序列如下：

polIV-F:5’atgcgtaaaa tcattcatgt

PolIV-R:5’gcaggtccgcagccccatcg

第三步，荧光信号放大反应。将第二步中的针对检测样本的4个反应混合物，放入荧光定量PCR仪中，进行PCR扩增和基因分型检测。

第四步，确定基因多态性。定量4个检测反应的荧光信号(图4)，根据4个反应体系和分子信标的序列特异性，结果显示分子信标rc的荧光信号最高，因此确定检测样本大肠杆菌DNA聚合酶IV待测位点的单核苷酸多态性为碱基G。

SEQUENCE LISTING

<110> 远见生物科技（上海）有限公司

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<212> DNA

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cgcgcctgac aacgatrugg aggaccgagg cgcg 34

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<212> DNA

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