一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明属于生物学领域，涉及一种动物病原微生物，具体来说是一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针和试剂盒。

背景技术：

钩端螺旋体属于螺旋体门，包括腐生钩端螺旋体和致病性钩端螺旋体。由致病性钩端螺旋体引起的病叫做钩端螺旋体病，是一种常见的人畜共患传染病。钩端螺旋体分为18个血清群，160多个血清型，其中波摩拿群、犬群、黄疸出血群、七日热群、流感伤寒群和塔拉索夫群是家畜常见的病原菌。我国是受钩体病危害严重的国家之一，自1955年被列入法定报告传染病以来，我国共计报告发病多达240多万例，其中死亡病例达2万多例。钩端螺旋体的宿主范围很广，其中对人有潜在危害的包括犬、鼠、猪和牛等。因此，加强对易感动物钩端螺旋体病的检测对防治该病十分重要。

钩端螺旋体病的诊断主要包括临床诊断和实验室诊断，但由于钩体病早期不具有特异性临床表现且症状复杂多样，极易误诊，因此该病要依靠实验室诊断。在实验室检测方法中分离培养和显微镜凝集试验是金标准，但是培养法时间较长（7-10天），凝集试验有一定的安全隐患。而酶联免疫吸附法在检测患病动物早期血清中的抗体时，由于抗体滴度较低，不易检测。随着分子生物学的发展，许多新的技术（如 PCR 技术）因其灵敏性高、特异性强、操作简便且迅速而被广泛应用于病原菌检测领域。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针和试剂盒，所述的这种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针和试剂盒要解决现有技术中诊断钩端螺旋体病时间长和准确度不高的技术问题。

本发明提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1、或者SEQ ID No:2 、或者SEQ ID No:3、或者SEQ ID No:4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。

本发明还提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

本发明还提供了一种用于检测致病性钩端螺旋体的试剂盒，其含有EQ ID No:1、或者SEQ ID No:2 、或者SEQ ID No:3、或者SEQ ID No:4所示上游引物序列，核苷酸序列如SEQ ID No:5所示的下游引物序列，还含有核苷酸序列如SEQ ID No:6所示的探针。

进一步的，所述的试剂盒中，还含有荧光定量PCR预混液、ROX 参比染料、去离子水、阳性对照和阴性对照。

进一步的，在采用上述的试剂盒扩增的过程中，其反应体系为：荧光定量PCR预混液10μl，ROX 参比染料 0.2μl，上游引物（10μM）0.4μl，下游引物（10μM）0.4μl，探针（20μM）0.8μl，DNA 2μl，去离子水 6.2μl；反应条件为：95℃ 15秒→（94℃ 5秒→58℃ 10秒→72℃ 15秒）×40。

本发明对所述试剂盒的反应体系和反应条件进行了优化，使得所述引物和探针能够最大程度的实现对致病性钩端螺旋体的检测。

本发明的方法具有较高的灵敏度，当模板浓度为58个拷贝/µl以上时，均可扩增出特异性产物。

本发明的方法可对致病性钩端螺旋体进行特异性检测。选择标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，七日热56610，流感伤寒56609，塔拉索夫56635，非致病性钩体566505和空白对照对本方法进行特异性检测，结果显示仅与致病性钩端螺旋体的核酸有特异性扩增。

本发明选择Lip32基因作为检测对象，仅对致病性钩端螺旋体有特异性扩增。所提供的引物、探针和试剂盒可用于钩端螺旋体病的早期诊断，组装的致病性钩端螺旋体荧光定量PCR试剂盒的检测灵敏度为58 copies/μl，可满足检测需求。

本发明在所述引物的存在下，加入上述探针，能够在荧光PCR仪上进行致病性钩端螺旋体的荧光定量PCR检测。

本发明以构建的阳性重组质粒为模板，将模板进行10倍倍比稀释，进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。通过PCR扩增致病性钩端螺旋体特有的LipL32基因上的片段，可快速、特异地对钩端螺旋体病进行排查和确诊。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明提供一种时效性强、灵敏度高、特异性好的检测致病性钩端螺旋体的荧光定量PCR检测方法，包括引物、探针和试剂盒。本发明选择了致病性钩端螺旋体所特有的LipL32基因作为检测对象，针对该基因设计了特异性的引物和探针，仅能高效扩增致病性钩端螺旋体，不扩增非致病性钩端螺旋体。

附图说明

图1是致病性钩端螺旋体荧光定量PCR标准曲线，其中每一条曲线对应一定浓度的DNA模板，从左至右，曲线代表的DNA模板浓度依次为5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/μl。

图2是致病性钩端螺旋体荧光定量PCR方法灵敏性实验，其中每一条曲线对应一定浓度的DNA模板，从左至右，曲线代表的DNA模板浓度依次为5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/μl。

图3是致病性钩端螺旋体荧光定量PCR方法特异性实验，从左至右，曲线代表的样品依次为致病性钩端螺旋体波摩那56608，犬56603，黄疸出血56601，塔拉索夫56635，七日热56610和流感伤寒56609。非致病性钩体566505和空白对照无扩增曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例 1引物设计与合成

从GenBank中下载已发表的Lip32基因序列32个，通过DNAstar软件进行序列比对，找出钩端螺旋体保守区域共6段，结合荧光定量PCR引物和探针设计要求，应用Primer Premier 5.0软件设计得到1对引物和1条探针，扩增长度150bp。筛选得到的引物通过NCBI中的BLAST进行特异性鉴定，引物、探针如下所示：

上游引物：RCCAGGCGAYGGAGACT

下游引物：GGTTTTGCTTTCGCAGCTTT

探针序列：ATGCCACATTGGTTTGA

R代表A或者G，Y代表C或者T。

实施例2标准质粒的构建和制备

本发明以我国钩端螺旋体参考标准株黄疸出血群赖型赖株56601（黄疸出血56601购自中国医学细菌保藏管理中心，保藏编号为56601，食地址：北京市崇文区天坛西里2# 邮编：100050电话：010-67095325传真：010-67057246)

采用Takara细菌DNA提取试剂盒提取DNA。用上述引物扩增Lip32基因，反应体系为50μl，包括：PCR预混液 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，去离子水 19μl，DNA 2μl。反应参数为：94℃加热解链30s，然后58℃退火30s，72℃延伸 30s，以上步骤共30个循环，再于72℃延伸10min。

1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，切胶，使用Takara 胶回收试剂盒回收目的片段。用TA克隆试剂盒，将所扩增的目的基因克隆至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α株，筛选阳性克隆并进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落送上海英骏生物技术有限公司进行测序验证，将测序验证正确的单克隆菌扩大培养。

采用Takara质粒提取试剂盒对菌液进行质粒的抽提与纯化，使用紫外分光光度计测定质粒浓度，质粒拷贝数=(6.02×10²³)×(ng/ul×10^-9) / (DNA length ×660) = copies/μl。

实施例3荧光定量PCR反应条件的优化

以实施例2中所得的DNA为模板，通过对反应体系中引物浓度、探针浓度和退火温度实验结果的比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型 S 型扩增荧光信号曲线、扩增效率接近1的反应体系。优化得到的反应体系为：荧光定量PCR预混液 10μl，ROX 参比染料 0.2μl，上游引物（10μM）0.4μl，下游引物（10μM）0.4μl，探针（20μM）0.8μl，DNA 2μl，去离子水6.2μl；优化得到的反应条件为：95℃ 15秒→（94℃ 5秒→58℃ 10秒→72℃ 15秒）×40。

实施例4荧光定量PCR标准曲线的建立

用去离子水将实施例2中获得的定量标准质粒进行10倍倍比稀释，浓度为5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/μl，每个稀释度做三个重复。用实施例3中最优化的体系和反应条件进行。

包括如下步骤：

1）目的基因的扩增

以黄疸出血56601的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收；

2）目的基因的克隆

将步骤1）所扩增的目的基因克隆至pMD18-T载体，转化至大肠杆菌DH5α株，筛选阳性克隆，扩大培养，提取质粒。

3）荧光定量PCR检测

以阳性重组质粒为模板，上下游引物为引物，进行荧光定量PCR反应，建立荧光定量PCR标准曲线。

绘制标准曲线（图1），结果显示，本检测方法具有良好的线性关系，标准曲线的相关性参数R2达到0.997。

实施例5 灵敏度试验

用去离子水将实施例2中获得的定量标准质粒进行10倍倍比稀释，浓度为5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/µl，用实施例3中最优化的体系和反应条件对本方法进行灵敏度检测。通过结果可以看出，本方法的检测灵敏度可达到58个拷贝/µl（图2）。

实施例6特异性试验

选择标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，七日热56610，流感伤寒56609，塔拉索夫56635，非致病性钩体566505和空白对照对本方法进行特异性检测，用实施例3中最优化的体系和反应条件对本方法进行特异性检测。通过结果可以看出，本方法仅与致病性钩端螺旋体的核酸有特异性扩增，图3中的扩增曲线从左至右依次为致病性钩端螺旋体波摩那56608，犬56603，黄疸出血56601，塔拉索夫56635，七日热56610和流感伤寒56609。非致病性钩体566505和空白对照无扩增曲线。

实施例7 临床样品的检测

2015年10月至2016年10月，共接收上海地区宠物医院送检的疑似钩端螺旋体患病犬猫血液和尿样40份，选用DNA提取试剂盒对样品进行核酸提取，利用上述方法进行荧光定量PCR检测。同时，采用钩体检测的金标准方法显微凝集试验（MAT）进行检测，对比检出率，结果显示，荧光定量PCR方法与MAT方法检出的阳性样品符合率为100%。

序列表

<110> 上海市动物疫病预防控制中心

<120> 一种用于检测致病性钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

accaggcgac ggagact 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 2

gccaggcgac ggagact 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 3

accaggcgat ggagact 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 4

gccaggcgat ggagact 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 5

ggttttgctt tcgcagcttt 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 探针

<400> 6

atgccacatt ggtttga 17