一种基因甲基化检测硫化剂及其应用的制作方法

本发明属于生物领域，特别涉及基因的甲基化检测中使用的硫化剂。

背景技术：

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下，S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’上，其中，80％的CpG二核苷酸是被甲基修饰的，其余的20％非甲基化的CpG二核苷酸高度聚集，广泛分布于启动子区域以及编码基因的第一外显子区，命名为CpG岛。CpG岛异常甲基化是肿瘤发生发展的一个重要因素，由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测。甲基化可作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。

DNA甲基化分析通常需要对DNA进行硫化转化修饰。提取的游离DNA经过硫化试剂作用，DNA上未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，再通过特异性的引物和探针进行PCR即可得到目的基因的甲基化情况及水平。

目前市场上常见的甲基化硫化方法大部分都是使用高浓度的亚硫酸氢钠作为硫化试剂。高浓度亚硫酸氢钠极其难溶，配制不方便且浪费时间，而且其硫化强度较弱，硫化所需时间较长，一般需要2-3个小时甚至是过夜。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明其中一个明的目的在于提供一种高效省时硫化强度高的硫化剂及其配套试剂盒和硫化方法。

根据本发明的一方面，提供了一种基因甲基化检测硫化剂，该硫化剂包括亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠；

根据本发明的一些方面，提供了一种基因甲基化检测硫化剂，硫化剂为亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合液，使用水作为溶剂；

根据本发明的一些方面，提供了一种基因甲基化检测硫化剂，其中亚硫酸氢铵所占体积比为55～95％，无水亚硫酸钠的浓度为0.1～0.2g/mL；

根据本发明的一些方面，提供了一种基因甲基化检测硫化剂，亚硫酸氢铵所占体积比为75％，所述无水亚硫酸钠为0.1g/mL；

根据本发明的还有一些方面，提供了一种包含上述硫化剂的基因甲基化检测硫化试剂盒，包括亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合液，还包括DNA保护液；

根据本发明的还有一些方面，提供了一种包含上述硫化剂的基因甲基化检测硫化试剂盒，试剂盒包括亚硫酸氢铵所占体积比为75％、无水亚硫酸钠浓度为0.1g/mL和DNA保护液，所述DNA保护液为VE(维生素E)和四氢呋喃的混合液，VE的浓度为0.125g/mL；

根据本发明的另一方面，提供了一种硫化基因的方法，该硫化方法使用上述的硫化试剂盒，方法如下：将100ul待检DNA溶液和190ul硫化试剂与30ul DNA保护液混合，在80°C反应1小时，所述待检DNA溶液中DNA含量0.1～2ng。

本发明主要解决的技术问题是传统硫化剂硫化效率低操作不便的问题，本发明的硫化剂硫化效率高、硫化完全、操作简单省时。

本发明采用的其中一个技术方案是：一种对基因甲基化硫化转化修饰的方法，包括步骤为：将待测DNA样品以硫化试剂进行高温硫化转化反应。进行PCR扩增反应，通过对所述的不同浓度的待测DNA样品的参数范围的判读，判断所述待测DNA样品的硫化程度，进而检测基因的甲基化情况。

本发明能够检测的DNA样品来源可为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。

本发明其中一种硫化转化反应体系为：100ul DNA+190ul硫化试剂+30ul DNA保护液。其中，硫化试剂为亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合液，所述DNA保护液为四氢呋喃和VE的混合液。

本发明其中一种的硫化转化的反应条件为：80℃反应1小时。本发明首次使用亚硫酸氢铵和无水亚硫酸钠的混合液作为DNA甲基化的硫化转化试剂，与市场上广泛应用的DNA甲基化硫化转化修饰用的硫化剂和方法相比，本发明的具有以下优点：(1)无水亚硫酸钠在亚硫酸氢铵中极易溶解，硫化试剂配制简单省时。(2)该方法全过程只需1个小时，且不需要98℃高温解链，实验操作简便快捷。(3)硫化完全，在(90％)非甲基化DNA存在的背景下仍能检测到目的基因的甲基化(结果见图2)；(4)硫化效率高，0.1ng阳性DNA经过本发明提供的硫化转化修饰方法仍能全部检出(结果见图2)，传统的硫化转化修饰方法检测的最低限为0.5ng。(5)安全，整个体系不包含有毒有害物质，对试验人员以及环境都无危害。

综上所述，本发明的一种对基因甲基化硫化转化修饰具有硫化效率高、硫化完全、试剂配制省时便宜、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对基因甲基化硫化转化修饰提供了一种更好的方法。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1是本发明的对基因甲基化检测中硫化转化修饰后甲基化模板和非甲基化模板的示意图.

图2是利用本发明的对基因甲基化硫化转化修饰方法中目的基因甲基化检测扩增曲线图.

图3是利用本发明的对基因甲基化硫化转化修饰方法和市场上常用的硫化转化修饰方法对比检测目的基因甲基化扩增的结果。

图4是本发明中不同浓度组成的硫化试剂对甲基化阳性DNA的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

基因甲基化检测中，如图1所示，经过硫化转化修饰后，DNA上未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，再通过特异性的引物和探针进行PCR即可得到目的基因的甲基化情况及水平。

实施例1

材料：待检血浆样本、0.1ng/ul甲基化阳性DNA样品、1ng/ul甲基化阴性DNA样品,甲基化阳性DNA样品和甲基化阴性DNA样品均来源于细胞。

仪器：Lightcycler 480、水浴锅、灭菌锅。

试剂：亚硫酸氢铵(日本WAKO公司)、无水亚硫酸钠(Aladdin)、四氢呋喃(Aladdin)、VE(Aldrich)

DNA来源于血浆DNA和细胞DNA，其中血浆DNA采用苏州工业园区为真生物医药有限公司的血浆游离DNA提取试剂进行提取；细胞DNA采用血液组织细胞DNA提取试剂(天根生化科技有限公司，货号：DP304)进行提取，反应用的总量一般为0.1ng～2ng。

硫化反应的体系和反应条件：硫化反应体系的组成为：100ul总量为0.5ng的DNA+190ul硫化试剂+30ul DNA保护液。硫化试剂为75％(v/v)的亚硫酸氢铵和0.1g/mL的无水亚硫酸钠的水混合液。DNA保护液为0.125g/mL的VE和四氢呋喃的混合液。

硫化转化反应的具体条件为：80℃反应1小时。如果不立即进行下步实验，可放置20℃保存至20小时。市场上常见的硫化转化修饰方法如若反应后不立即进行下步实验一般需放置在4℃冰箱中保存，本发明可放置于室温20小时，不会影响实验结果。

图4中的曲线1表示75％(v/v)的亚硫酸氢铵和0.1g/mL的无水亚硫酸钠组成的硫化试剂对甲基化阳性DNA的检测结果。若有扩增信号，且呈S型扩增曲线，说明有甲基化存在；若无扩增曲线升起，说明未发生甲基化，扩增的Cp值越小，证明效果越好。图4曲线1的结果显示，扩增曲线呈S型，Cp为30左右，证明本发明的硫化方法硫化效果较好。

进行上述硫化转化反应后，对修饰后DNA进行纯化回收，最后进行PCR检测，PCR扩增曲线如图2所示：其中曲线1表示利用本发明的硫化方法，在90％非甲基化DNA存在的背景下目的基因的甲基化检测结果，结果显示，扩增曲线呈S型，扩增结果较好，证明在90％非甲基化DNA存在的背景下也可检测到目的基因的甲基化表达，说明本发明的硫化方法硫化较完全，硫化效果好；曲线2表示血浆样本DNA经本发明的硫化方法硫化后的扩增曲线图，结果证明了本发明的硫化方法可用于检测血浆DNA甲基化；曲线3表示0.1ng的完全甲基化的阳性DNA即低浓度的甲基化DNA经过本发明提供的硫化方法仍能准确检出。说明本发明的硫化方法硫化效率高。

本技术发明人用市场上常用的zymo硫化方法和本发明提供的硫化方法做对比实验，检测20ng全甲基化阳性DNA，验证了本发明提供的DNA甲基化硫化转化修饰反应对后续反应不会产生负面影响，如图3所示：其中曲线1为利用市场上常用的zymo硫化方法检测目的基因甲基化扩增的结果；曲线2为利用本发明的对基因甲基化硫化转化修饰方法检测目的基因甲基化扩增的结果。两种方法的扩增曲线均呈现标准的S型，且Cp值无明显差别，证明两种方法效果一致，说明本发明提供的DNA甲基化硫化转化修饰反应对后续反应不会产生负面影响，硫化较完全。并且发明人验证未加无水亚硫酸钠，直接用亚硫酸氢铵水溶液硫化后反应液会有白色絮状沉淀出现，加入无水亚硫酸钠后，无沉淀产生。

实施例2

材料：1ng/ul甲基化阳性DNA样品，甲基化阳性DNA样品来源于细胞。

仪器：Lightcycler 480、水浴锅、灭菌锅。

试剂：亚硫酸氢铵(日本WAKO公司)、无水亚硫酸钠(Aladdin)、四氢呋喃(Aladdin)、VE(Aldrich)

细胞DNA采用血液组织细胞DNA提取试剂(天根生化科技有限公司，货号：DP304)进行提取，反应用的总量一般为0.1ng～2ng。

硫化反应体系的组成为：100ul总量为1.0ng的DNA+190ul硫化试剂+30ul DNA保护液。

硫化试剂为55％(v/v)的亚硫酸氢铵和0.15g/mL的无水亚硫酸钠的混合液。DNA保护液为0.125g/mL的VE和四氢呋喃的混合液。

硫化转化反应的具体条件为：80℃反应1小时。进行上述硫化转化反应后，对修饰后DNA进行纯化回收，最后进行PCR检测，PCR扩增结果如图4中的曲线2，结果显示，扩增曲线呈S型，Cp为32左右，说明本发明的硫化方法硫化效果较好。

实施例3：

材料：1ng/ul甲基化阳性DNA样品，甲基化阳性DNA样品来源于细胞。

仪器：Lightcycler 480、水浴锅、灭菌锅。

试剂：亚硫酸氢铵(日本WAKO公司)、无水亚硫酸钠(Aladdin)、四氢呋喃(Aladdin)、VE(Aldrich)

细胞DNA采用血液组织细胞DNA提取试剂(天根生化科技有限公司，货号：DP304)进行提取，反应用的总量一般为0.1ng～2ng。

硫化反应体系的组成为：100ul总量为1.0ng的DNA+190ul硫化试剂+30ul DNA保护液。

硫化试剂为95％(v/v)的亚硫酸氢铵和0.2g/mL的无水亚硫酸钠的混合液。DNA保护液为0.125g/mL的VE和四氢呋喃的混合液。

硫化转化反应的具体条件为：80℃反应1小时。进行上述硫化转化反应后，对修饰后DNA进行纯化回收，最后进行PCR检测，PCR扩增结果如图4中的曲线3，结果显示，扩增曲线呈S型，Cp为32左右，说明本发明的硫化方法硫化效果较好。