一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法与流程

本发明涉及分子标记领域，具体提供了一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法。

背景技术：

黄瓜砧木合力二号是山东省华盛农业股份有限公司最新培育的优良黄瓜砧木品种，该品种嫁接亲和力好，嫁接后黄瓜长势壮旺，抗病性增强。嫁接后瓜条黑亮顺直，提高了商品性。适宜保护地春秋及越冬种植。该品种在杂交制种过程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，母本去雄不彻底或漏去雄，都将会极大地影响制种纯度。因此鉴定杂交砧木种子纯度至关重要。

传统的砧木杂交种子纯度鉴定工作仍然以田间种植鉴定为主，通过嫁接黄瓜外观形状比较鉴定，该方法鉴定一般需要2个月，时间长、费用高、难度大且准确性差，需要鉴定人员具有丰富的经验，且易受栽培措施和环境条件的影响，严重影响品种鉴定的效率及准确性，越来越不能满足现代育种工作和生产经营的需要。

室内纯度检测通常采用分子标记技术，该技术从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境条件和栽培措施的影响，无组织、器官及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的限制，多态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。现有技术中出现过采用三对引物运用多重PCR的方法进行南瓜纯度鉴定，但不能检测相应砧木纯度，且多重PCR体系复杂，所需时间较长，无法再短时间内获得鉴定结果，同时成本较高，难以在本领域广泛推广应用；因此如何利用该技术更好更快的实现对黄瓜砧木合力二纯度的鉴定成为亟待解决的问题之一

技术实现要素：

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法，该方法采用专门设计的EST-SSR引物，以合力二的基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测黄瓜砧木合力二的F1代种子纯度进行检测，采用这种方法可以在黄瓜砧木合力二植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；准确性高，应用推广前景广阔，为开展砧木制种和良种的及时销售提供科学依据。

本发明所针对的黄瓜砧木品种为合力二，合力二是山东省华盛农业股份有限公司经多年研究选育出的优良黄瓜砧木品种，该品种嫁接亲和力好，嫁接后黄瓜长势壮旺，抗病性增强。嫁接后瓜条黑亮顺直，提高了商品性。适宜保护地春秋及越冬种植。

为了对合力二进行品种纯度的鉴定，获得母本和父本的优良杂交品种，本发明的发明人首先提供了一对EST-SSR引物，命名为HELI2，其正向序列为5’-GAATCAGAGGAAGGTTTGCG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为5’-CACTTCCTTCATGCTTCTCG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，

在获得上述引物之后发明人利用其对待测品种黄瓜砧木合力二的杂交种及其亲本的幼根基因组DNA进行了扩增，具体过程如下：

(1)提取黄瓜砧木合力二杂交种及其亲本幼根基因组DNA；

(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物HELI2进行PCR扩增：

PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCR Buffer 1μL，0.2mM dNTPs，DNA模板100ng，引物各5μM，0.5U Taq DNA聚合酶，无菌超纯水补齐至10μL；

扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃；

发明人经过多次试验后发现，针对本发明的发明目的，以及专门设计的特异性引物，扩增程序中将退火温度设置为55℃时，扩增效果最好，最终检测的结果更加贴近与实际情况，故而将本发明的退火温度设定为55℃。除此之外，与现有的其他类似扩增程序相比，发明人针对合力二进行品种纯度鉴定的要求，将预变性和变性温度提高到95℃，使得变性效果更好，同时将72℃延伸时间缩短，每个循环缩短了40s，使得整个鉴定过程更快，且对结果没有任何不良影响。

(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；

其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1；

所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液；

(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定“黄瓜砧木合力二”杂交种的纯度，判定标准为：

母本具有177bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；父本具有159bp特异谱带,其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；杂交种具有159bp和177bp两条特异谱带；

根据上述鉴定结果，可以换算黄瓜砧木合力二品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N为待测砧木种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“黄瓜砧木合力二”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。

上述方法中发明人并没有采用常规的叶片提取基因组DNA的方式，而是选用了幼根提取这样就大大缩短了材料生长时间，这是由于发明人经过多次试验后发现，针对本发明的发明目的，选取幼根可提取出适合纯度鉴定的基因组DNA，与叶片无差别甚至更加准确，但选取幼根会大大缩短材料准备时间，较之采用叶片提取基因组DNA的方式缩短了7天，同时提取幼根更加方便快捷。

利用上述方法，即可实现对黄瓜砧木合力二品种纯度的快速检测，能够不受栽培措施和环境条件的影响；无器官、组织及发育特异性，该方法在植株生长的任何时期均可进行鉴定，同时将最低检测时限从叶片期降低到了幼根期，大大缩短了待测植株的培育时间；多态性丰富、共显性遗传：能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；该方法在苗期即可进行鉴定，节省大量人力、物力和土地资源；重复性和稳定性较好；快速高效：一周之内即可完成种子纯度鉴定工作；准确性高：该方法从基因组水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，克服了田间表型鉴定带来的误差；应用推广前景广阔：可以快速、准确检测“黄瓜砧木合力二”杂交种纯度。

附图说明

图1为本发明杂交种“黄瓜砧木合力二”种子检测特征引物的PCR电泳图谱，

其中，P1为“黄瓜砧木合力二”母本；F1为多组“黄瓜砧木合力二”F1杂交种；P2为“黄瓜砧木合力二”父本，

结果显示：“黄瓜砧木合力二”F1杂交种拥有分别来自父、母本的177bp和159bp的两条带；

图2为不同PCR退火温度对“黄瓜砧木合力二”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱；

其中，P1为“黄瓜砧木合力二”母本；F1为“黄瓜砧木合力二”F1杂交种；P2为“黄瓜砧木合力二”父本，

结果显示，最佳退火温度在55℃时，最易区分黄瓜砧木合力二杂交种纯度；

图3为不同DNA模板量对“黄瓜砧木合力二”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱，

其中，P1为“黄瓜砧木合力二”母本；F1为“黄瓜砧木合力二”F1杂交种；P2为“黄瓜砧木合力二”父本，

结果显示，DNA模板量从100ng至1000ng均可用于“黄瓜砧木合力二”商品种子样品的纯度检测。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；下数实施例中的百分比除特殊注明外，均为重量百分比。

实施例1 黄瓜砧木合力二品种幼根基因组DNA的获取

具体操作方法如下：

(1)将“黄瓜砧木合力二”亲本与F1种子放入铺有潮湿滤纸的培养皿中，30℃黑暗培养3d后取幼根；

其中，该品种在杂交制种过程中,母本需要人工去雄，授以父本花粉来完成杂交过程，最后收获母本上的F1代种子；

(2)每个离心管中放入一个幼根，加入60-65℃预热的500μL提取缓冲液，放入钢珠4粒，于破碎机上将材料打碎，60-65℃水浴20-30min；

其中所述的提取缓冲液为2×CTAB提取液，其配比如下：

高温灭菌，冷却至室温，加2mL巯基乙醇，室温保存，

(3)上步获得的液体经10000rpm/min离心10min，取上清于另一离心管，加入等体积(500μL)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25:24:1)混合液；

(4)上步混合液经10000rpm/min离心10min，取上清液于另一离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24:1)混合溶液；

(5)上步混合液经10000rpm/min离心10min，取上清溶液于另一离心管中，加入400μL异丙醇混匀；

(6)上步混合液经12000rpm/min离心15min，弃上清，固体物质用70％乙醇洗涤，晾干；

(7)向上述固体中加入200μL ddH₂O回溶，加入1μLRNA酶37℃水浴30min，-20℃备用。

实施例2 PCR扩增

以上述获得的RNA酶解混合物为模板，利用HELI2引物进行PCR扩增：

PCR反应体系为10μL，其中包括10×PCR Buffer 1μL，0.2mM dNTPs，引物各5μM，0.5U Taq DNA聚合酶，模板100ng，无菌超纯水补齐至10μL；

根据本发明针对性设置扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸20s，35个循环；72℃终延伸5min；PCR产物保存于10℃。

实施例3 扩增产物检测

5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；

所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液；

其中所述的12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶配方(100mL)如下：

其中所采用的30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺配置过程如下：

丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g蒸馏水定容至100mL 4℃避光保存，保质期一个月；

所采用的10╳TBE配置过程如下：

Tris Base 27g，硼酸13.75g，0.5M/L EDTA 10mL，蒸馏水定容至250mL，调pH至8.3；

所采用的10％过硫酸铵(APS)以过硫酸铵0.1g和蒸馏水1mL的比例现用现配。

电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，具体过程如下：

1.水洗：ddH₂O水洗2次，每次1min；

2.染色：用1‰AgNO₃浸泡，平行摇动10-15min；

3.水洗：倒掉显色液，ddH₂O水洗2次，每次1min；

4.显影：在盘中加入显色液(每升显色液中含有16g氢氧化钠和8mL甲醛，余量为纯净水)，然后平行摇动直至显影清楚；

5.终止：用终止液(每升终止液中含有7.5g碳酸化钠，余量为纯净水)浸泡2min，后加入ddH₂O水清洗1-2次；最后用相机照相保存。

实施例4 鉴定“黄瓜砧木合力二”杂交种的纯度

根据特异谱带的电泳结果鉴定“黄瓜砧木合力二”杂交种的纯度，判定标准为：

母本具有177bp特异谱带；父本具有159bp特异谱带；杂交种具有159bp和177bp两条特异谱带；

根据上述鉴定结果，可以换算黄瓜砧木合力二品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N为待测西瓜种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“黄瓜砧木合力二”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。

实验例

以2015年生产的黄瓜砧木合力二种子为例，收获F1代种子后马上将F1代种子进行催芽萌发，大约2d后取幼根提取砧木基因组DNA，利用本发明的黄瓜砧木合力二分子标记进行纯度鉴定，4d即可获得的种子纯度结果；

利用常规鉴定方法即田间种植形态鉴定：需到海南进行加代纯度鉴定，生长周期约为60天左右，且受到多种恶劣天气影响，可能需多次重复播种鉴定，鉴定时间不好估计。具体比较如下表：

可见与常规鉴定方法相比较，利用该分子标记法鉴定黄瓜砧木合力二杂交种子纯度快速高效、操作简单、重复性好、成本较低。

<110>李兴盛

<120>一种利用分子标记快速鉴定黄瓜砧木合力二纯度的方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gaatcagagg aaggtttgcg 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cacttccttc atgcttctcg 20

<210>3

<211>159

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaatcagagg aaggtttgcg aagactgaag aatgttagat gaggaacatc aggaaaagca 60

tgaatctgca gttagaagga tagttgattt gtaaatattg tttgctcaat aagaacgaga 120

acgagaacga gaacgagaac gagaagcatg aaggaagtg 159

<210>4

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gaatcagagg aaggtttgcg aagactgaag aatgttagat gaggaacatc aggaaaagca 60

tgaatctgca gttagaagga tagttgattt gtaaatattg tttgcttaat aagaacgaga 120

acgggaacga gaacgagaag aagaacgaga agaagaacga gaagcatgaa ggaagtg 177