抑制人和动物中TIMP-1基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种sirna、一种药物组合物及其应用；具体地，涉及能够抑制人和动物中timp-1基因表达的sirna分子、含有该sirna分子的药物组合物及其应用。
背景技术：
：肝纤维化是继发于各种形式慢性肝损伤之后的组织修复过程中的代偿反应，也是慢性肝病发展为肝硬化、肝癌等严重致死性疾病的必经病变过程，所以抗肝纤维化成为慢性肝病治疗的重中之重。目前治疗肝纤维化的手段非常有限，主要包括两大方面：一是针对原发病去除致病因素，如抗病毒、戒酒等；二是针对肝纤维化本身的治疗，如通过抑制炎症或脂质过氧化，或者抑制hsc的增殖活化，以及促进胶原降解等。临床药物中，使用干扰素抑制星状细胞的激活和增殖细胞外基质的表达，使用拉米夫定抑制hbvdna的复制，使用秋水仙碱和水飞蓟素干扰细胞的胶原分泌。但这些药物对肝纤维化的治疗效果不确切，对肝纤维化患者生存率也无明显改善，而副作用发生率却明显增加。基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(timp-1)是近年发现的一种由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，抑制细胞外基质降解的蛋白。从分子水平来看，在纤维化发病过程中，timp-1的表达升高是关键事件之一。抑制这一基因的表达，能够增强细胞外基质的降解，减少组织胶原纤维的合成和堆积，从而有可能避免纤维化的发生。前期研究以腺病毒为载体实现肝靶向递送针对timp-1的sirna，结果显示timp-1sirna在ccl4和bdl纤维化模型中均显示出显著的抗纤维化效果(amjpathol.2013,182(5):1607-16)，提示timp-1可以作为治疗纤维化的靶点基因，用于纤维化的治疗。然而迄今为止，用于治疗与timp-1基因表达相关的疾病的sirna药物临床应用进展缓慢，其中，sirna本身的活性和在血液中的稳定性较差，是影响该类药物进展缓慢的原因之一。因此，迫切需要开发一种具有潜在临床应用价值的，具有良好稳定性和生物活性的，用于治疗与timp-1基因表达相关的疾病的sirna和含sirna的药物组合物。技术实现要素：本发明提供具有良好生物活性和潜在临床应用价值的、用于治疗与timp-1基因表达相关的疾病的sirna和含sirna的药物组合物及其应用。特别是提供具有良好生物活性、稳定性和潜在临床应用价值的，用于治疗与timp-1基因表达相关的疾病的sirna和含sirna的药物组合物及其应用。第一方面，本发明提供了一种能够特异性靶向timp-1的sirna，所述sirna为双链结构，包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链含有如seqidno:1或seqidno:5所示的核苷酸序列，或含有与seqidno:1或seqidno:5的序列存在1个不同的核苷酸的序列；所述反义链含有如seqidno:2或seqidno:6所示的核苷酸序列，或含有与seqidno:2或seqidno:6的序列存在1个不同的核苷酸的序列，其中，正义链：5’-cguuaugagaucaagauga-3’(seqidno:1)，反义链：5’-ucaucuugaucucauaacg-3’(seqidno:2)；正义链：5’-gcagcgaggaguuucucau-3’(seqidno:5)，反义链：5’-augagaaacuccucgcugc-3’(seqidno:6)；第二方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明提供的sirna以及药学上可接受的载体；所述sirna与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)，优选为1:(1-50)。第三方面，本发明还提供了本发明的sirna和/或药物组合物在制备用于治疗或改善与timp-1基因表达相关的疾病的药物中的应用。第四方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有本发明提供的sirna和/或药物组合物。第五方面，本发明提供了一种治疗或改善纤维化病症的方法，该方法包括将本发明提供的sirna和/或药物组合物给予有需要的患者。第六方面，本发明提供了一种抑制timp-1基因在细胞中表达的方法，该方法包括将本发明提供的sirna和/或药物组合物导入所述细胞。本发明提供的sirna具有良好的活性，在细胞水平上，50nm的sirna对timp-1mrna的抑制率高达90％以上。本发明提供的修饰的sirna分子活性基本保持不变，同时能够在血液中稳定存在72小时以上。特别需要说明的是，本发明提供的sirna在不同物种中具有高度同源性，由于这种高度同源性，一方面，在不同物种间的试验可以采用相同序列的sirna及其药物组合物，减少根据不同动物的基因构成而合成不同序列sirna的过程，可以大大缩短动物实验进程，快速进入临床试验，另一方面，也避免采用不同序列sirna带来的，对相应动物timp-1mrna抑制效率、稳定性的不确定性，从而可以加速药物研发进程。本发明提供的药物组合物在动物体内可以有效地抑制timp-1mrna的表达，从而抑制或改善肝纤维化的发展进程；特别地，通过将由含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质这三种组分形成的脂质混合物用作药学上可接受的载体与本发明的sirna形成药物组合物，可将本发明的sirna特异性地递送至肝脏，并在大大降低给药剂量的同时显示出更出色的mrna抑制作用。具体表现为，在ccl4诱导的肝纤维化大鼠模型上，不同剂量的本发明的药物组合物(2mg/kg、1mg/kg和0.5mg/kg)对肝timp-1mrna的抑制效率高达80％以上；在正常sd大鼠中，在给药剂量仅为由其它常规载体形成的药物组合物的2/5的情况下，该药物组合物的timp-1mrna抑制效率高达由其它常规载体形成的药物组合物的近3倍，甚至可达到10倍之多。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式中予以详细说明。附图说明图1：sirnat2、t2u、t4、t4a修饰前后的血清稳定性电泳图；图2：rbp131/t2m1、rbp131/t2um1和rbp131/t4m3药物组合物在ccl4肝纤维化模型大鼠体内对肝组织中timp-1mrna的抑制效率；图3：根据肝纤维化病理国际评分标准进行专家打分，评估rbp131/t2m1、rbp131/t2um1和rbp131/t4m3药物组合物在ccl4肝纤维化模型大鼠体内对肝纤维化的治疗效果；图4：rbp131/t2um1在ccl4肝纤维化模型大鼠上的剂量依赖实验结果。具体实施方式以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。1、sirna本发明中使用的timp-1基因的mrna序列为genebank注册号：nm_003254.2所示的序列。本发明提供了一种sirna，所述sirna为双链结构，包括完全互补的正义链和反义链，其中所述正义链含有如seqidno:1或seqidno:5所示的核苷酸序列，或含有与seqidno:1或seqidno:5的序列存在1个不同的核苷酸的序列；所述反义链含有如seqidno:2或seqidno:6所示的核苷酸序列，或含有与seqidno:2或seqidno:6的序列存在1个不同的核苷酸的序列，其中，正义链：5’-cguuaugagaucaagauga-3’(seqidno:1)，反义链：5’-ucaucuugaucucauaacg-3’(seqidno:2)；正义链：5’-gcagcgaggaguuucucau-3’(seqidno:5)，反义链：5’-augagaaacuccucgcugc-3’(seqidno:6)；优选地，所述sirna正义链含有如seqidno：3或seqidno:7所示的核苷酸序列，所述sirna反义链含有如seqidno:4或seqidno:8所示的核苷酸序列，其中正义链：5’-cguuaugagaucaagaugx-3’(seqidno:3)，反义链：5’-ycaucuugaucucauaacg-3’(seqidno:4)；正义链：5’-gcagcgaggaguuucucax’-3’(seqidno:7)，反义链：5’-y’ugagaaacuccucgcugc-3’(seqidno:8)；其中，x为u、c和g中的一种，y是与x互补的核苷酸；x’为a、c和g中的一种，y’是与x’互补的核苷酸；更优选地，x为u，y为a；x’为a，y’为u。为了增强sirna双链的稳定性，按照本发明的一个实施方式，相互互补的正义链和反义链中至少一条单链的3’末端还连接有1至3个额外核苷酸，从而在所述正义链和所述反义链互补配对后形成至少一个由1至3个核苷酸构成的3’突出端；优选地，所述3’突出端为连续的2个脱氧胸腺嘧啶核苷酸dtdt或尿嘧啶核苷酸uu；更优选地，正义链和反义链都含有3’突出端。为了进一步提高sirna在血液中的稳定性，避免在体内遭到核酸酶降解，按照本发明的一个实施方式，相互互补的正义链和反义链中的至少一条单链中的至少一个核苷酸为含有修饰基团的核苷酸，所述修饰基团可以是现有的各种起到提高sirna稳定性的修饰基团。这些修饰方式可参见watts,j.k.,g.f.deleavey,andm.j.damha,chemicallymodifiedsirna:toolsandapplications.drugdiscovtoday,2008.13(19-20):p.842-55。在本发明所述sirna的一些实施方式中，相互互补的正义链和反义链中的至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和核糖基。优选情况下，具有修饰基团的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基或者为2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的一个氧原子被硫原子取代而成的硫代磷酸酯基；所述硫代磷酸酯基结构如式vi所示：式vi。按照本发明的一个具体实施方式，本发明提供的sirna为以下i～xii中任意一种：(i)t2m1：正义链为：5’-cmgumumaumgagaumcmaagaumga-dt-s-dt-3’，反义链为：5’-ucmaufcufufgaucufcaufaacg-dt-s-dt-3’；(ii)t2m2：正义链为：5’-cmguumaumgagaucmaagaumga-dt-s-dt-3’，反义链为：5’-ucmaucuufgaucucfaufaacg-dt-s-dt-3’；(iii)t2um1：正义链为：5’-cmgumumaumgagaumcmaagaumgu-dt-s-dt-3’，反义链为：5’-acmaufcufufgaucufcaufaacg-dt-s-dt-3’；(iv)t2um2：正义链为：5’-cmguumaumgagaucmaagaumgu-dt-s-dt-3’，反义链为：5’-acmaucuufgaucucfaufaacg-dt-s-dt-3’；(v)t4m1：正义链为：5’-gcmagcmgaggagumumumcmumcmaum-dt-s-dt-3’，反义链为：5’-aumgagaaacuccufcgcufgc-dt-s-dt-3’；(vi)t4m2：正义链为：5’-gcmagcmgaggagumuumcucmau-dt-s-dt-3’，反义链为：5’-aumgagaaacuccufcgcufgc-dt-s-dt-3’；(vii)t4m3：正义链为：5’-gcmagcgaggaguuumcucmau-dt-s-dt-3’，反义链为：5’-aumgagaaacuccucgcufgc-dt-s-dt-3’；(viii)t4m4：正义链为：5’-gcmagcgaggagumuumcucmau-dt-s-dt-3’；反义链为：5’-aumgagaaacuccufcgcufgc-dt-s-dt-3’；(ix)t4am1：正义链为：5’-gcmagcmgaggagumumumcmumcmaa-dt-s-dt-3’；反义链为：5’-uumgagaaacuccufcgcufgc-dt-s-dt-3’；(x)t4am2：正义链为：5’-gcmagcmgaggagumuumcucmaa-dt-s-dt-3’；反义链为：5’-uumgagaaacuccufcgcufgc-dt-s-dt-3’；(xi)t4am3正义链为：5’-gcmagcgaggaguuumcucmaa-dt-s-dt-3’；反义链为：5’-uumgagaaacuccucgcufgc-dt-s-dt-3’；(xii)t4am4：正义链为：5’-gcmagcgaggagumuumcucmaa-dt-s-dt-3’；反义链为：5’-uumgagaaacuccufcgcufgc-dt-s-dt-3’；其中，小写字母m表示该字母左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-甲氧基核糖基；小写字母f表示该字母左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-氟代核糖基；小写字母d表示该字母右侧的一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸；小写字母s表示该字母两侧的脱氧核糖核苷酸之间磷酸酯基为硫代磷酸酯基。本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过本领域常规的sirna制备方法(例如固相合成和液相合成)得到本发明所述的sirna。其中，固相合成已经有商业化订制服务，苏州瑞博生物技术有限公司也具有此类固相合成能力。可以通过使用具有相应修饰的核苷酸单体将修饰的核苷酸引入本发明所述的sirna中，制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法及将修饰的核苷酸引入sirna的方法也是本领域技术人员所熟知的。2、组合物在本发明的药物组合物中，含有本发明所述的sirna和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是sirna给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magneticnanoparticles，如fe3o4、fe2o3)、碳纳米管(carbonnanotubes)、介孔硅(mesoporoussilicon)、磷酸钙纳米粒(calciumphosphatenanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)、聚酰胺胺型树形高分子(polyamidoamine(pamam)dendrimer)、聚l-赖氨酸(poly(l-lysine)，pll)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，dotap)、聚d型或l型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(d&l-lactic/glycolicacid)copolymer，plga)、聚(2-氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethylethylenephosphate)，ppeea)和聚(甲基丙烯酸-n,n-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，pdmaema)以及它们的衍生物等。在本发明的药物组合物中，对sirna和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，一般地，sirna与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)，优选为1:(1-50)。在本发明的药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括ph值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述ph值缓冲液可以为ph值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或ph值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为ph值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡糖糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。优选地，所述药物组合物用于静脉注射给药。在本发明的药物组合物的一个优选实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一个更优选的实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺化合物、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于cn201180060664.1(通过引用将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。具体而言，所述含胺化合物可为cn201180060664.1中描述的如式i所示的化合物或其药学上可接受的盐：式i，其中：x1和x2各自独立地是o、s、n-a或c-a，其中a是氢或c1-c20烃链；y和z各自独立地是c＝o、c＝s、s＝o、ch-oh或so2；r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；x是1-10的整数；n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1，其中，如果m＝p＝0，那么r2是氢，并且，如果n或m中的至少一个是2，那么r3和在式i中的氮形成如式ii或式iii所示的结构：其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“hcc”代表烃链，且每个*n表示在式i中的氮原子。在某些实施方式中，r3是多胺。在其它实施方式中，r3是缩酮。在某些实施方式中，在式i中的r1和r2中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。在某些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么r3和在式i中的氮可形成如式vii-式xvi所示结构中的任意一种：其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“hcc”代表烃链，且每个*n表示在式i中的氮原子。其中，式i所示化合物可以根据cn201180060664.1中的描述制备。优选地，所述含胺化合物可为cn201180060664.1中描述的含胺化合物72(记为式iv)或含胺化合物87(记为式v)，如下所示：优选地，所述辅助脂质可以是胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物等。优选地，所述聚乙二醇化脂质可以是1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，即1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]。在本发明的药物组合物的一个更优选的实施方式中，所使用的药学上可接受的载体同时包含上文所描述的含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质这三种组分，这三种组分形成脂质混合物。在该优选的实施方式中，所述药物组合物中含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)。更优选地，所述药物组合物中含胺化合物、辅助脂质、聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(50-70)：(20-40)：(3-20)。由本发明的sirna与上述脂质混合物形成的脂质体颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。在脂质体制剂形式的药物组合物中，本发明的sirna与全部脂质(例如含胺化合物、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本发明的sirna与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。本发明提供的药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。本发明提供的含有上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备。按照本发明一个实施方式，本发明提供的药物组合物与上述脂质混合物形成的药物组合物可以根据cn201180060664.1中的描述方法制备；更优选地，可以按照如下方法制备：将含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/ml，优选为8-18mg/ml。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400中的一种或多种，优选为乙醇。将本发明提供的sirna溶解于缓冲盐溶液中，得到sirna水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5m，优选为0.1-0.2m，调节缓冲盐溶液的ph至4.0-5.5，优选为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使sirna的浓度不超过0.6mg/ml，优选为0.2-0.4mg/ml。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，优选为醋酸钠和/或醋酸钾。将脂质溶液和sirna水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，优选5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和sirna水溶液的体积比为1：(2-5)，优选1:3。将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本发明提供的药物组合物，其理化参数为ph值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mosm/kg；优选地，ph值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mosm/kg。其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，优选使用切相流系统，中空纤维柱，在100kda条件下超滤，超滤交换溶液为ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)。除菌的方法可以采用现有各种方法，优选在0.22μm滤器上过滤除菌。3、试剂盒本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明提供的sirna和/或如药物组合物。按照本发明提供的试剂盒，sirna、药学上可接受的载体和/或辅料可以单独存在，以其中两种或两种以上的混合物的形式存在，或者以最终药物组合物的形式存在。当药学上可接受的载体单独存在且所述载体为上述脂质混合物时，含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可以各自独立存在，也可以以其中两种或三种的混合物的形式存在。在一个实施方式中，可使一个容器用于提供sirna、另外一个或多个容器用于提供含胺化合物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质，任选地另外一个或多个容器提供辅料。除了sirna和药学上可接受的载体和/或辅料以外，所述试剂盒中还可包含实现本发明提供的药物组合物的一种或多种特定应用所必需或有益的组分，如(1)一种或多种用于实现所希望的细胞转染的组分，(2)一种或多种用于实现特定疾病或身体障碍的诊断、治疗或预防的组分，如一种或多种额外的治疗化合物或组合物、一种或多种诊断试剂，(3)一种或多种缓冲剂，(4)阳性或阴性对照样品，(5)赋形剂、稳定剂或防腐剂等。一般来说，所述组分存在于与sirna和药学上可接受的载体和/或辅料的容器均不同的容器中。此外，所述试剂盒还可包含用于将sirna与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分进行混合的说明书。在本发明提供的试剂盒中，所述sirna和药学上可接受的载体和/或辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。优选所述sirna和药学上可接受的载体和/或辅料基本上纯净和/或无菌。可任选地在本发明的试剂盒中提供无菌水、生理盐水、pbs中的一种或多种。4、sirna分子或组合物的应用本发明提供了如上所述sirna和/或药物组合物在制备用于治疗或改善与timp-1基因表达相关的疾病的药物中的应用。本发明还提供了一种治疗或改善肝纤维化病症的方法，该方法包括将本发明提供的sirna和/或药物组合物给予患有上述病症的患者，通过rna干扰的机制达到治疗或改善与timp-1基因表达相关的疾病的目的。本发明所述的与timp-1基因表达相关的疾病是与纤维化相关的疾病，这样的疾病具体的例子包括但不限于：肝纤维化、肾纤维化(ckd，包括esrd)、肺纤维化(包括ilf)、腹膜纤维化、声带纤维化、肠纤维化、骨髓纤维化、心脏纤维化、与脑梗死相关的纤维化、与全部可能类型的意外或医源性(手术)皮肤损伤相关的异常瘢痕化(疤痕疙瘩)、硬皮病、青光眼滤过术失败、肠粘连、肝硬化或慢性肝损伤。本发明所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将sirna或药物组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将sirna或药物组合物放置入受试者体内。适于本发明方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多sirna或药物组合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述sirna或药物组合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本发明旨在提供治疗和/或改善肝纤维化的手段，优选能够将药物递送至肝脏的给药方式。可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每个月或每年1次或多次。本发明所述的sirna或药物组合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。在给予本发明所述的药物组合物时，例如，对于雄性、6-8周龄、体重180-200g的sd大鼠，通过静脉给药方式，以所述药物组合物中的sirna的量计，其sirna用量可以为0.001-50mg/kg体重，优选为0.01-10mg/kg体重，更优选为0.05-5mg/kg体重，最优选为0.1-3mg/kg体重。按照本发明另外一个实施方式，本发明提供了一种抑制timp-1基因在细胞中表达的方法，该方法包括将本发明提供的sirna和/或药物组合物导入所述细胞。通过将本发明的sirna和/或药物组合物导入细胞，可以通过rna干扰的机制达到抑制timp-1基因的表达这一目的。所述细胞为肝星状细胞、肾星状细胞、或肺星状细胞。采用本发明提供的方法抑制timp-1基因在上述细胞中表达，无论使用提供的sirna还是药物组合物，sirna用量一般是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处100pm至1μm、或1nm至100nm、或5nm至50nm或至约10nm的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。实施例本发明的内容将通过下述具体实施例进行具体描述，但本发明的范围不限于以下具体内容。如无特别说明，以下实施例中使用的试剂为生化试剂商店中可以买到的常规试剂，所使用的方法为本领域技术人员所熟知的方法。制备实施例1本发明以timp-1mrna(genebank注册号：nm_003254.2)的350-500bp的高保守区为sirna设计的模板，得到7条物种同源(人、大鼠、恒河猴同源)的sirna，其序列信息见表1。同时，设置正义链核苷酸序列如seqidno.23所示、反义链核苷酸序列如seqidno.24所示的sirna，编号为nc。nc为与timp-1mrna无对应靶作用位点的无关序列，作为阴性对照。表1:7条靶向timp-1的sirna信息上述sirna正义链1-18位核苷酸序列与timp-1mrna的靶作用位点完全相同，第19位碱基与之相同或不同；反义链2-19位核苷酸序列与timp-1mrna的靶作用位点完全匹配，第1位碱基与之匹配或不匹配。其中，t2u和t1u是指sirna反义链第1位碱基为a，与mrna靶作用位点错配，对应的正义链第19位碱基为u；t4a是指sirna反义链第1位碱基为u，与mrna靶作用位点错配，对应的正义链第19位碱基为a。其他5条sirna反义链与mrna的靶作用位点完全匹配。通过常规固相合成方法得到表1中所列的sirna。用退火盐溶液溶解等摩尔的正义链和反义链混合物，随后常规退火以形成sirna双链，其中，双链的两端分别具有dtdt的3’突出端。实验实施例1本实验实施例用于检测制备实施例1中得到的sirna在体外对timp-1mrna表达水平的抑制率。通过双萤光素酶报告基因检测系统dlrtm(cat.e1960，购自promega公司)在细胞水平上检测sirna的体外抑制活性。根据文献du,q.,biochem.biophys.res.commun.,2004,325(1):243-249所述的方法，将含有sirna靶作用位点的序列克隆到报告基因萤火虫萤光素酶(fireflyluciferase)的编码区，使之位于该基因内源的翻译起始密码子atg的前端，形成融合基因，从而通过检测萤光素酶的表达水平来反应sirna抑制靶基因的表达水平。人胚肾细胞系(hek293a，购自atcc)使用含10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素的dmem完全培养基培养。转染前一天，以8×104个细胞/孔的密度将细胞接种至24孔板中，当细胞密度达到60-70％时，弃dmem完全培养基，更换为i无血清培养基，每孔0.5ml，准备转染。利用lipofectaminetm2000(invitrogen)共转染sirna和双萤光报告质粒。在50μli无血清培养基中稀释包含sirna靶序列及萤火虫萤光素酶报告基因的siquant质粒(100ng/孔)、表达海肾萤光素酶的prl对照质粒(50ng/孔)及sirna(0.3μl2μm/孔、0.3μl200nm/孔、0.3μl20nm/孔)，同时设置加入sirnanc的阴性对照。按1:50的比例将1μllipofectaminetm2000加至另一份50μli无血清培养基中，轻轻混匀，室温放置5分钟后，将含质粒和sirna的溶液与含lipofectaminetm2000的溶液混匀，室温放置20分钟，随后将此转染混合物100μl加入单个细胞培养孔中。至此，sirna终浓度依次为1nm、0.1nm、0.01nm。hek293a细胞在i无血清培养基中，置于37℃二氧化碳培养箱培养4小时后，向每孔中补加1mldmem完全培养基，继续培养24小时。细胞转染后24小时，收集细胞裂解液，使用双萤光素酶报告基因检测系统dlrtm测定萤光素酶活性。具体方法如下：利用负压泵将24孔板中的培养基除去，每孔中加入500ml1×pbs，洗去死细胞；移除1×pbs，每孔加入100μl1×plb(细胞裂解液)，将24孔板置于水平摇床摇20分钟，使细胞充分裂解；将100μl细胞裂解液加入500μl离心管中，10000转/分钟离心1分钟，使细胞碎片沉下；取10μl上清，加入96孔测量板中；每孔中加入50μl萤火虫萤光素酶检测试剂(luciferaseassayreagentii)，用酶标仪synergytmht(biotek)读取萤光强度，再加入50μl海肾萤光素酶检测试剂(stop&reagent)，继续读值；检测完成后，导出数据进行分析。用每孔萤火虫萤光素酶信号除以内参海肾萤光素酶信号，剔除系统偏差。timp-1sirna的抑制效率是与经sirnanc处理的样品比较而得。每次实验设置三个副孔，至少重复两次。sirna体外抑制活性见表2。表2：7条sirna序列的体外抑制活性由此可见，sirnat2、t2u、t4、t4a相对其他4种sirna抑制效果更好，0.1nm下，抑制率在83％以上。t1u和t3在mrna上的靶作用位点与t2和t2u的靶作用位点仅相距1个核苷酸，但t2和t2u活性更好；t5和t6在mrna上的靶作用位点与t4的靶作用位点也相距1个核苷酸，但它们之间的活性差异更为显著。制备实施例2对上述7条sirna中活性最好的4条序列(t2、t2u、t4、t4a)及阴性对照nc进行合理的化学修饰，其修饰信息见表3。表3：修饰的sirna分子的序列其中，大写字母c、g、u、a和t表示核苷酸的碱基组成；小写字母d表示该字母d右侧的一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸；小写字母m表示该字母m左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-甲氧基核糖基；小写字母f表示该字母f左侧的一个核苷酸的核糖基团为2’-氟代核糖基；小写字母s表示该字母两侧的脱氧核糖核苷酸之间磷酸酯基为硫代磷酸酯基。通过常规固相合成方法得到表3中所列的sirna，常规退火后形成sirna双链。实验实施例2本实验实施例用于检测修饰前后sirna在体外对timp-1mrna表达水平的抑制率。将人类宫颈癌细胞株(hela)(购自atcc，ccl-2tm)用含有10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素的dmem完全培养基接种培养于24孔板，接种密度为4×105细胞/孔，每孔0.5ml，37℃培养过夜。细胞转染的具体操作步骤如下：将50ng或500ng制备实施例2中合成的各sirna样品及其修饰前sirna样品，分别稀释于50μlopti-mem无血清培养基中，同时将1μllipofectaminetm2000(invitrogen公司)稀释于50μlopti-mem无血清培养基中，将上述两种溶液分别在室温下孵育5分钟后，均匀混合。混合溶液于室温静置20分钟后，把100μl的上述混合溶液加入到接种有hela细胞的24孔板中。sirna的最终浓度约为5nm和50nm。将细胞于37℃培养4小时，再加入1ml含10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素的dmem完全培养基，然后在37℃再培养24小时。以无转染操作的细胞作为背景对照(记为con)，转染无关sirnanc作为阴性sirna对照(记为nc)，转染timp-1sirna作为测试组。通过荧光定量实时pcr(qrt-pcr)检测分别转染了不同sirna的hela细胞中timp-1mrna的表达量，具体步骤如下：在培养转染的细胞24小时后，用rneasyminikit(qiagen公司)提取细胞中的总rna。每个样品取2μg总rna按照primescripttm1ststrandcdnasynthesiskit(takara公司)的使用方法反转录得到cdna，利用premixextaqtm(takara公司)试剂盒进行荧光定量实时pcr反应。pcr条件如下：95℃预变性10min，进入循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃延伸10min。其中，用于扩增timp-1和作为定量pcr反应的内参基因β-actin的pcr扩增引物如表4所示。表4：定量pcr检测用引物序列sirna分子对timp-1mrna表达水平的抑制率按如下等式计算：timp-1mrna抑制率＝[1-(测试组timp-1rna的拷贝数/测试组β-actinmrna的拷贝数)/(背景对照组timp-1mrna的拷贝数/背景对照组β-actinmrna的拷贝数)]×100％。结果如表5所示。表5从表5可以看出，sirnat2、t2u、t4、t4a经化学修饰后，其抑制活性与未修饰sirna相比，活性相当，50nmsirna在细胞水平的基因抑制率在88％以上，5nmsirna的抑制率在80％以上，仍然能够高效抑制靶基因timp-1的表达。实验实施例3本实验实施例检测制备实施例l、2中得到的sirna分子在血清环境中的稳定性。将制备实施例1、2中得到的未修饰和修饰的sirna(20μm，10μl)与50μl胎牛血清(fbs，购自hyclone，货号gtb0060)和40μlpbs混合，在37℃下体外孵育一定时间后取样，具体而言，分别在0、2、4、6、8、24、48、72小时取出10μl样本，并立即进行液氮速冻，随后冻存于-80℃备用。配制20重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶；取10μl上述样品与4μl上样缓冲液(20mmedta，36重量％甘油，0.06重量％溴酚蓝)混合，取1μl20μm未经血清处理的sirna与4μl上样缓冲液混合，作为电泳marker，上样，在80ma恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×sybrgold染料(invitrogen，cat.11494)染色15分钟后成相，结果如图1所示。以nc和nc-m作为实验阳性和阴性对照。由图1可以看出，sirnat4加入fbs后，主带(指与marker所示的条带平行的带，代表全长序列)可以保留至48h；而经修饰的sirnat4m1、t4m2、t4m3和t4m4，其主带在血清中稳定存在的时间能够延续至72h，大大地推迟了sirna的降解时间，表现出很高的血清稳定性。类似的，经过修饰的t2、t2u和t4a的血清稳定性显著高于未修饰的sirna。说明本发明的sirna分子，特别是修饰后sirna分子具有作为药物在动物体中使用的可能。制备实施例3：sirna药物组合物的制备本制备实施例用来制备sirna药物组合物rbp131/sirna及rbp130/sirna。将三种干粉脂质化合物，即含胺化合物(如式iv或式v所示，其制备方法参见cn201180060664.1中的化合物72或87)、胆固醇、聚乙二醇化脂质(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]以59:29:12的摩尔比悬浮于乙醇中并混合，三种脂质化合物的总质量浓度约为8.85mg/ml。将待测sirna(制备实施例2中的nc-m、t2m1、t2um1、t4m3)分别溶解于200mm醋酸钠(ph5.2)溶液中，使sirna的浓度为0.2mg/ml。以1:3的体积比，快速混合所得到的脂质乙醇溶液和sirna醋酸钠水溶液。在表6中描述了混合后得到的脂质体制剂的具体组成。表6脂质体制剂的组成将混合后得到的脂质体制剂在约50℃孵育10分钟。孵育后，使用切相流系统，中空纤维柱100kda超滤，超滤交换溶液为ph7.4的pbs。超滤的同时可以将制剂浓缩或稀释到期望的sirna浓度。超滤后的制剂在0.22μm滤器上过滤除菌。将由式v所示的含胺化合物、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的脂质混合物称为rbp131，由式iv所示的含胺化合物、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]组成的脂质混合物称为rbp130。所得药物组合物rbp131/sirna或rbp130/sirna在使用前储存在4℃，并检测相关理化性质，rbp131/sirna和rbp130/sirna的理化参数相似，检测结果见表7。表7rbp131/sirna和rbp130/sirna的理化参数检测指征参数范围ph7.2-7.6包封率(％)≥90％sirna浓度(mg/ml)0.10-0.15粒径(nm)60-100pdi≤0.20渗透压(mosm/kg)300-400其中，包封率采用ribogreen法检测，所用试剂(quant-ittmrnareagentandkit)购于thermofisher(invitrogen)公司，货号r11490。根据说明书操作步骤检测样品中sirna的荧光强度，再按照文献(j.heyeset.al,journalofcontrolledrelease,107(2005):276–287)所述方法计算包封率：包封率＝[(triton处理组荧光强度-无triton处理组荧光强度)/triton处理组荧光强度]×100％其他理化参数采用本领域技术人员熟知的常规技术手段检测。实验实施例4本实验实施例用于检测制备实施例3中的rbp131/sirna药物组合物在ccl4肝纤维化模型大鼠体内对肝组织中timp-1表达水平的抑制率，通过专家打分评价药物组合物对肝纤维化的治疗效果。(1)大鼠给药方法将6-8周龄36只sd大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分成6组(每组6只，均为雄性)，分别记为正常对照组(未经任何处理，标记为normal)、ccl4造模-pbs组，ccl4造模-rbp131/nc-m组、ccl4造模-rbp131/t4m3组、ccl4造模-rbp131/t2m1组和ccl4造模-rbp131/t2um1组。ccl4造模如下：用橄榄油(化学纯，国药集团化学试剂公司)溶解25体积％的ccl4(分析纯，国药集团化学试剂公司)，对小鼠进行腹腔注射，5μl/g体重，每周注射两次。第三周开始与造模平行，每周两次，尾静脉注射rbp131/sirna药物组合物，给药日在腹腔注射ccl4的次日进行。所有动物根据体重计算药量，sirna给药剂量为1mg/kg，体积为5ml/kg。连续给药四周，最后一次给药后24h将动物处死，对动物进行大体解剖，观察体内脏器是否有病变，收集肝脏。(2)大鼠肝脏组织timp-1表达水平检测将采集的肝脏组织的一部分放入rnalater(sigmaaldrich公司，货号r0901)中保存，采用实时荧光定量pcr法检测肝组织中timp-1mrna的表达水平。用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用trizol(thermofisher公司，货号15596026)根据说明书操作步骤提取得到总rna。使用improm-iitm反转录试剂盒(promega公司)按其说明书将提取的总rna逆转录为cdna，接着使用2×ultrasybrmixture(withrox)(北京康为世纪生物科技有限公司，货号cw0956)试剂盒，以cdna为模板按照说明书的步骤进行timp-1mrna的表达量的检测。其中，用于扩增timp-1和作为内参基因的β-actin的pcr引物如表8所示。表8：检测引物序列sirna抑制活性用timp-1基因表达剩余量表示，按如下等式计算：timp-1基因表达量＝(测试组timp-1的拷贝数/测试组β-actin的拷贝数)/(对照组timp-1的拷贝数/对照组β-actin的拷贝数)×100％。其中，各测试组为分别经rbp131/nc-m、rbp131/t2m1、rbp131/t2um1和rbp131/t4m3处理的ccl4模型大鼠；对照组为经pbs处理的ccl4模型大鼠。结果如图2所示。(3)专家打分，评估药物组合物治疗肝纤维化的效果将采集的肝脏组织的另一部分用甲醛固定，进行肝纤维化病理评分。甲醛固定的肝脏组织，经基本的脱水、透明和包埋后，用石蜡进行切片，按照masson染色方法进行染色，包括：脱蜡，复水；铬化处理；自来水漂洗，苏木素染核；masson丽春红酸性复红，酸化，脱水，透明，封片等。切片在显微镜下观察，按照文献(zhaoxyet.al.pathologyinternational2008；58:580–588)的评价标准，至少两人进行纤维化双盲打分，然后对不同处理组的打分结果进行统计分析，结果如图3所示。其中，肝纤维化病理国际评分标准如下：0分：无纤维化形成；1分：肝小叶静脉附近开始有轻微纤维生成；2分：小叶静脉间隔板开始形成；3分：小叶静脉隔板积累，不完全分割肝小叶；4分：小叶静脉间隔板完全分割肝小叶，形成假小叶；5分：小叶静脉和汇管区间隔板中度形成，假小叶进一步增加；6分：大量小叶静脉和汇管区间隔板中度形成，假小叶面积超过50％。由图2可以看出，在ccl4诱导的肝纤维化大鼠模型上，rbp131/t4m3、rbp131/t2m1和rbp131/t2um1，通过尾静脉每周两次给药，给药剂量为1mg/kg，连续给药4周，能够有效抑制肝脏timp-1mrna的表达，抑制效率分别为50％、82％和81％；而阴性对照rbp131/nc-m对肝组织timp-1基因mrna无抑制作用。通过切片可以看出，与ccl4造模的pbs组相比，rbp131/t4m3、rbp131/t2m1和rbp131/t2um1组的肝脏胶原纤维生成量有所下调，小叶静脉间隔板积累减少，假小叶形成也显著减弱。图3所示的打分结果表明，经rbp131/t4m3、rbp131/t2m1和rbp131/t2um1治疗的大鼠，其肝脏纤维化症状得到了有效改善。实验实施例5本实验实施例用于检测制备实施例3中不同剂量的药物组合物rbp131/t2um1在ccl4肝纤维化模型大鼠体内对肝组织中timp-1表达水平的抑制率。造模及给药方法参见实验实施例4，每组8只动物，sirna给药剂量分别为：2mg/kg、1mg/kg和0.5mg/kg，检测结果如图4所示。由图4可以看出，在ccl4诱导的肝纤维化大鼠模型上，不同剂量的rbp131/t2um1均能有效降低大鼠肝脏timp-1的表达水平，抑制效率在80％以上，且不同剂量组间的抑制效率并无太大差异。实验实施例6本实验实施例利用不同厂商生产的商业化sirna体内给药载体，包括invivofectamine2.0(购自lifetechnology)、invivojetpei(购自polyplus-transfection(pt))、entranster(购自engreenbiosystem)以及本发明所述的rbp131、rbp130，包载携带sirnat2m1后，在正常sd大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)中通过检测对timp1mrna表达量的抑制效率分析不同的药物组合物的药效。根据生产商提供的标准操作流程，将本发明的sirnat2m1包裹进上述商业化载体中，制备相应的载体/sirna组合物，分别标记为ivf2.0/t2m1、invivojetpei/t2m1、entranster/t2m1。同时，按照制备实施例3的方法，制备rbp131/t2m1和rbp130/t2m1组合物。将36只6-8周龄sd大鼠按体重随机分成6组(每组6只，雌雄各半)，分别为pbs对照组、ivf2.0/t2m1、invivojetpei/t2m1、entranster/t2m1、rbp131/t2m1和rbp130/t2m1样品组。所有动物根据体重计算药量，尾静脉单次给药，ivf2.0/t2m1、invivojetpei/t2m1、entranster/t2m1三组的给药剂量为2.5mg/kg(sirna)，rbp131/t2m1和rbp130/t2m1组的给药剂量为1mg/kg(sirna)，所有组别的给药体积为5ml/kg。给药后第3天将动物处死，对动物进行大体解剖，观察体内脏器是否有病变，对肉眼观察有病变的组织用10％福尔马林保存进一步进行病理观察。收集肝脏，用rnalater保存；用组织匀浆仪匀浆肝组织，再用trizol根据总rna提取的标准操作步骤提取得到总rna。采用实时荧光定量pcr检测肝组织中timp1mrna的表达水平。检测方法同实验实施例4所述。sirna对timp-1mrna表达水平的抑制率按如下等式计算：mrna抑制率＝[1-(测试组timp1的拷贝数/测试组β-actin的拷贝数)/(对照组timp1的拷贝数/对照组β-actin的拷贝数)]×100％。其中，对照组为本实验中施以pbs的对照组大鼠，各测试组为分别施以不同药物组合物的给药组大鼠。所测各组供试品在sd大鼠中对timp1mrna表达抑制活性如表9所示。表9：不同药物组合物对timp-1sirna的表达抑制率供试品sirna给药剂量mrna抑制率1×pbs0mg/kg0％ivf2.0/t2m12.5mg/kg45％invivojetpei/t2m12.5mg/kg31％entranster/t2m12.5mg/kg8％rbp131/t2m11mg/kg81％rbp130/t2m11mg/kg75％由表9可以看出，即便与由其它商业化载体形成的药物组合物中效果最好的ivf2.0/t2m1组相比，rbp131/t2m1组对sd大鼠肝脏中timp1mrna的抑制率也提高了36％；同时，rbp131/t2m1组的抑制活性是invivojetpei/t2m1组的2.6倍、是entranster/t2m1组的10倍。进而，考虑到rbp131/t2m1组的给药剂量仅为其它三组的2/5，相较于由其它商业化载体形成的药物组合物而言，rbp131/t2m1显示出极高的生物活性。此外，rbp130/t2m1与rbp131/t2m1的效果类似，都显示出极高的抑制活性。本发明提供的sirna是一种有效治疗或改善肝纤维化的全新手段，通过抑制timp-1基因的表达，使得肝脏胶原纤维生成量有所下调，小叶静脉间隔板积累减少，假小叶形成也显著减弱，从而极大改善肝脏纤维化症状。另外本发明提供的rbp131/sirna或rbp130/sirna药物组合物靶向肝脏，可有效降低肝脏中timp-1基因的表达，治疗或改善肝纤维化，本发明的药物组合物具备临床研究的必要性和商业化的现实性。以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所发明的内容。当前第1页12