本发明涉及外显子组
技术领域：
，具体涉及一种外显子组装测序方法。
背景技术：
：外显子组(exome)是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，它是基因行使其功能最直接的体现。通过进行外显子组测序，能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变。由于外显子仅占人类全基因序列的1％，而且是极其关键的1％，相比于全基因组重测序，外显子组测序更加经济、高效。目前，外显子组测序技术已经应用到寻找与各种复杂疾病相关的致病基因和易感基因的研究中。虽然外显子测序技术目前是基因研究的一个重要手段之一，但是无论是传统的外显子单个捕获测序法，或者近年来兴起的高通量测序，在全外显子测通的成本上还是依然居高不下，使得外显子测序难以得到广泛的应用。人类基因上外显子数量一般较多，而且大部分外显子的长度在100-300bp之前，如果对这些小的外显子单个捕获后测序不仅工作量大，成本也高。现有的外显子除了传统的Sanger法还有近几年兴起的高通量测序。传统的Sanger测序主要是利用UniplexPCR和MutliplexPCR方法富集目标区域序列，然后再对单独捕获的外显子序列进行测序。而新一代测序技术则是把基因组DNA片段化，然后在其两侧连上接头，用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR单克隆阵列，所有单克隆同时独立地进行引物杂交和酶延伸反应，并对每个延伸所摄入的荧光标记信号进行拍摄从而得到测序数据，但得到的数据量却是十分庞大的，要在如此庞大的数据中分析出有意义的内容也是一个大的挑战。现有的基因外显子测序方法基本上都是设计多对引物分别扩增出每个外显子再进行测序，但是人类基因上的外显子数量较多，一般多达20-30个，这样对每一个外显子都进行单独扩增测序不仅步骤繁琐、工作量大，而且测序数量大，成本昂贵。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种外显子组装测序方法。为了解决
背景技术：
所存在的问题，本发明的一种外显子组装测序方法，它的方法为：对分散在基因各处的外显子序列进行捕获，在基因上临近外显子的区域设计多对引物把这些外显子序列通过PCR的方法扩增下来，同时通过多重PCR技术，设计引物时Tm值相似而且尽量避免引物之间错配，使得这些引物能够放在同一反应体系中进行同时扩增；然后在多重PCR的基础上，在引物之间加上一段特异的序列-overlap，使得几个外显子之间能够在扩增的同时通过overlap组装起来，成为一个含有多个外显子片段的大扩增子，再对该大扩增子进行一次测序便能够得到多个外显子序列信息。本发明有益效果为：使得外显子测序工作能够以更有效的方式、更低的成本进行；大大减少了测序的反应数从而降低实验成本。附图说明图1为本发明的组装图。具体实施方式下面结合附图，对本发明作进一步的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。如图1所示，本具体实施方式采用如下技术方案：它的方法为：对分散在基因各处的外显子序列进行捕获，在基因上临近外显子的区域设计多对引物把这些外显子序列通过PCR的方法扩增下来，同时通过多重PCR技术，设计引物时Tm值相似，使得这些引物能够放在同一反应体系中进行同时扩增；然后在多重PCR的基础上，在引物之间加上一段特异的序列(overlap)，使得几个外显子之间能够在扩增的同时通过overlap组装起来，成为一个含有多个外显子片段的大扩增子，再对该大扩增子进行一次测序便能够得到多个外显子序列信息。本具体实施方式的工作原理为：在使用多重PCR技术扩增多个外显子片段的同时，利用基因合成的原理把4-6个小的外显子片段搭建起来，组成一个大的完整的扩增子，这样可以通过一个测序反应便能得到4-6个外显子的序列信息，大大减少了测序的反应数从而降低实验成本。这种外显子组装测序技术可以应用到许多基因的外显子测序工作中，使得外显子测序工作能够以更有效的方式、更低的成本进行。以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。实施例1：TP53基因的外显子组装测序1.从人的外周血中提取基因组利用DNA提取试剂盒(Qiagen)提取人外周血单个核细胞基因组DNA，具体地，包括：1)将20μlQIAGEN蛋白酶加入200μl血细胞样品中，混匀。2)将200μl缓冲液AL加入样品中，充分混匀，56℃孵育10分钟。3)加入200μl无水乙醇，充分混匀，将混合物转移到吸附柱上，8000r/m离心1分钟，弃废液。4)然后加入500μl缓冲液AW1，8000r/m离心1分钟，弃废液。5)再加入500μl缓冲液AW2，8000r/m离心1分钟，弃废液。6)然后全速(14000r/m)空甩1分钟。7)再加入200μl缓冲液AE，室温静置1分钟，8000r/m离心1分钟，以便提取获得DNA，保存于-20℃，备用。2.多重PCR扩增以上一步得到的DNA作为模板，采用基因TP53的外显子引物组进行多重PCR扩增。引物信息如下表：引物名称序列TP53-exon1FATGTTAGTATCTACGGCACCAGGTCGGCGAGAATCCTP53-exon1RAAATACACGGAGCCGAGAGCCCGTGACTCAGATP53-exon89FGCTCTCGGCTCCGTGTATTTTGGGAGTAGATGGAGCCTGGTTP53-exon89RAAACGGCATTTTGAGTGTTAGACTGGAAACTTTCCACTTGTP53-exon10FGTCTAACACTCAAAATGCCGTTTGTACCGTCATAAAGTCAAACAATTP53-exon10RAAGGCAGGATGAGAATGGAATCCTATGGCTTTCCAACCTATP53-exon234FTCTCAGACACTGGCATGGTGTTGGGGGAGGGGGTTCTP53-exon234RGGGATACGGCCAGGCATTGAAGTCTCATGGAAGCTP53-exon56FGGAGGTGCTTACGCATGTTTGTTTCTTTGCTGCCGTP53-exon56RCCAGTGCGCCTTGAACCACCCTTAACCCCTCCTCCTP53-exon7FAGGGGTTAAGGGTGGTTCAAGGCGCACTGGCCTCATCTP53-exon7RGTGGATGGGTAGTAGTATGGAAGAAATCGGTAAGAGGTGGGCTP53-exon11F1CCAGCCTTAGGCCCTTCAAAGCATTGGTCAGTP53-exon11R1GTCAGACAGGGTTTGGCTGGGCCAGCAGAGACTP53-exon11F2CCCTTGAGGGTGCTTGTTCCCTCTCCCTGTTP53-exon11R2CCCCAGCCCACACTCATTGCAGACTCAGGT具体地，首先，将浓度均为100μM的引物稀释成10μM，并按照将各引物按F、R等浓度混合获得引物组。然后，按下表的配比，配制多重PCR扩增的反应体系：组分体积(μl)基因组模板10-50ng引物组1(exon1)1.5引物组2(exon89)1.5…(exon10)1.510xMultiplexPCRbuffer3.2dNTPs(2mM)2TaqDNApolymerase1总体积20然后，将配制好的反应体系按一下反应条件进行PCR扩增：一轮扩增结束后，取一轮产物为模板，按下表的配比，配制第二轮PCR扩增的反应体系：组分体积(μl)一轮产物1exon1-F(10p)1exon10-R(10p)110xMultiplexPCRbuffer2dNTPs(2mM)2TaqDNApolymerase0.5总体积20然后，将配制好的反应体系按一下反应条件进行PCR扩增：3.琼脂糖凝胶电泳纯化回收扩增完成后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行分离，获得目的条带后切胶回收，利用PCR纯化试剂盒纯化回收目的片段，该片段即可用于测序。4.测序与数据分析对纯化回收得到的含多个外显子的片段测定浓度后，进行Sanger测序。根据得到的测序结果，与参考序列进行比对，确认外显子是否有缺失、突变等。当前第1页1 2 3