本发明涉及β-葡聚糖的制备方法，具体涉及一种纯化制备高品质生物多糖的方法。
背景技术：
多糖是指一类由10个以上单糖分子聚合而成的天然高分子化合物，广泛分布于动物、植物、微生物(细菌和真菌)和藻类地衣中。多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等功效，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的应用前景。
β-葡聚糖是一种天然多糖。在自然环境中可以找到相当多种类的β-葡聚糖，通常存在于特殊种类的细菌、酵母菌、真菌(灵芝)的细胞壁中，也可存在于高等植物种子的包被中。其中以β-1,3-糖苷键为骨架的蘑菇葡聚糖具有增强免疫力、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能，在保湿、抗皱、抗氧化、抗紫外、促进伤口愈合等方面也具有显著效果，此外，与传统的酵母或谷物葡聚糖相比，蘑菇葡聚糖具有更均一稳定的结构、更高的分子质量及更为优良的水溶性。因此高粘度、高透光率的蘑菇β-葡聚糖溶液广泛应用于食品、化妆品及制药领域，制备高粘度、高透光率的蘑菇β-葡聚糖溶液具有重要的意义。
目前，β-葡聚糖的提取方法主要有两种，其一是从燕麦等谷物或蘑菇等子实体真菌中直接提取；其二是通过真菌或细菌的液体发酵，经由对发酵液进行提取加工，以获得β-葡聚糖。发酵法制备β-葡聚糖，纯化时需要除去发酵过程中产生的核酸及蛋白质等杂质，传统方法使用酸碱处理或酶处理来去除核酸和蛋白质，成本高昂且酸碱处理会对葡聚糖造成破坏。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种纯化制备高品质β-葡聚糖的方法，本发明方法操作简便，无需经酸碱及酶解处理，所制备得到的β-葡聚糖溶液具有高粘度、高透光率。
本发明提供的一种β-葡聚糖的制备方法，包括下述步骤：
(1)将裂褶菌发酵液和水混合进行浸煮，得浸煮液；
(2)对步骤(1)所述浸煮液进行固液分离，取清液；
(3)在步骤(2)得到的清液中加入活性炭，进行吸附处理，得含炭混合物；对所述含炭混合物进行固液分离，取清液；
(4)将步骤(3)得到的清液与乙醇混合进行醇析，收集析出的固体；
(5)将步骤(4)中所述固体进行干燥，即可得到所述β-葡聚糖。
上述的制备方法中，步骤(1)中，所述裂褶菌发酵液可采用常规液体发酵方法制备，可为普通发酵条件制备或者发酵条件优化后制备得到的裂褶菌(schizophyllumcommunefr.)发酵液。具体可通过如下步骤制备得到：
(a)裂褶菌菌种活化：将马铃薯200g/l、葡萄糖20～30g/l、氯化钠10～20g/l、琼脂15～20g/l制成平板培养基，把裂褶菌菌种接种到该平板培养基上，于20℃～30℃恒温培养箱内培养4～10天得到平板菌丝体；
(b)种子活化：将马铃薯淀粉50～200g/l、葡萄糖20～60g/l、酵母浸膏1～10g/l、酵母浸粉1～10g/l、水制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/5～1/3，取步骤(a)所得的平板菌丝体接种该摇瓶，于20℃～30℃恒温摇床内100～220rpm震荡培养4～10天，作为种子液；
(c)发酵培养：将葡萄糖20～80g/l、蔗糖50～100g/l、黄豆粉5～30g/l、酵母浸粉1～10g/l、磷酸二氢钾0.1～2g/l、七水合硫酸镁0.1～2g/l、硫酸铵0.1～2g/l、硝酸钾1～10g/l、水制成的发酵培养基加入发酵罐中115～128℃灭菌15～30分钟，再将步骤(b)所得的种子液接种上述发酵罐中，20℃～30℃恒温100～600rpm搅拌2～10lpm通气发酵培养5～10天。
所述裂褶菌发酵液和水的体积比可为1：(0.1～100)，具体可为1：(1～10)、1：(1～5)、1：(1～4)、1：(3～5)、1：(3～4)1：1、1：3、1：5或1：10；所述浸煮的温度可为30～121℃，具体可为50～90℃、50～70℃、60～90℃、50℃、60℃、70℃或90℃，时间可为0.2～120h，具体可为0.5～8h、0.5～4h、2～8h、0.5h、2h、4h或8h。
上述的制备方法中，步骤(2)中，所述固液分离可以使用的方法可为离心、正压过滤及负压过滤中的至少一种，具体可为下述1)-3)中的任一种：1)在500～13000rpm(如4000rpm)下离心1～120min(如5min)；2)用100～1500目(如300目)的滤布进行负压抽滤；3)先在500～13000rpm(如4000rpm)下离心3～60min(如5min)，然后再用100～1500目(如300目)的滤布进行负压抽滤。所述抽滤，可加或不加助滤剂。如加助滤剂，可为0.1-10％的活性炭、硅藻土、珍珠岩、纤维素等。
上述的制备方法中，步骤(3)中，所述活性炭可为木质活性炭和/或果壳活性炭，所述果壳活性炭具体可为椰壳活性炭；所述木质活性炭和所述果壳活性炭的添加体积均为所述清液的0.1％～10％，具体可为0.75％～2.5％、0.75％～2％、1％～2.5％、0.75％、1％、2％或2.5％；所述活性炭的粒度可为8～400目，具体地，所述木质活性炭的粒度可为8～300目、8～30目、20～60目、200目或300目；所述果壳活性炭的粒度可为8～200目，具体可为8～16目、40～60目。
所述吸附处理的温度可为4～99℃，具体可为4℃～80℃、4℃、40℃、50℃或80℃，处理时间可为0.1～24h，具体可为4～16h、4h或16h。所述吸附处理，可附以搅拌，包括三种吸附方式，即1)静置吸附，仅搅拌混匀后，持续静置吸附；2)持续搅拌吸附；3)间歇性搅拌吸附，仅搅拌混匀后，每10～60min(如30min)间歇搅拌一次。所述搅拌的转速可为1～1000rpm，具体可300～350rpm、300rpm或者350rpm。
所述固液分离可以使用的方法可为离心、正压过滤及负压过滤中的至少一种，具体可为用100～30000目(如300目、5000目)的过滤装置进行负压抽滤，如依次使用300目滤布及5000目滤板进行负压抽滤。
上述的制备方法，步骤(4)中，所述清液和乙醇的体积比可为1：(0.1～100)，具体可为1：(1～10)、1：3、1：1、1：5或1：10。所述乙醇以体积浓度为70％～100％的乙醇的水溶液(如体积浓度为95％的食用乙醇)的形式进行添加。所述醇析可进行一次以上，如所述醇析还可包括将所述固体重新溶于水中，得到β-葡聚糖溶液，将所述β-葡聚糖溶液与乙醇混合再次进行醇析，收集再次醇析固体的步骤。所述再次醇析中，β-葡聚糖溶液和乙醇的体积比可为1：(0.1～100)，具体可为1：2、1：1；所述乙醇以体积浓度为70％～100％的乙醇的水溶液(如体积浓度为90％或95％的食用乙醇)的形式进行添加。
上述的制备方法，步骤(5)中，所述干燥可用的方法为热干燥、减压干燥、喷雾干燥及低温冻干中的任一种，具体可为在30～130℃(如40～60℃、40℃、50℃或60℃)下烘干至恒重。
由上述的制备方法制备得到的β-葡聚糖，也在本发明的保护范围内。该β-葡聚糖制成的水溶液具有高粘度、高透光率。
本发明还提供了β-葡聚糖溶液的制备方法，包括如下步骤：将所述β-葡聚糖粉碎后溶解于水中，搅拌后进行过滤，收集清液，即可得到所述β-葡聚糖溶液。
上述的制备方法中，所述溶解可在常温(15～30℃)或者加热状态下进行，加热温度可为30～121℃，具体可为40～80℃、40℃、70℃或者80℃。所述搅拌可为1)不持续搅拌；2)持续搅拌，转速可为1～1000rpm(如600～800rpm、600rpm或800rpm)，时间可为0.2～8h(如2～6h、2h、4h或6h)。
所述过滤可以使用的方法为正压过滤、负压过滤及膜过滤中的至少一种，如采用1～150μm(如5～10μm、5μm或10μm)的滤膜进行负压过滤或者采用100～30000目(如300目)的滤布或滤板进行负压过滤。
所述β-葡聚糖溶液的浓度可为0.01～10.0％，具体可为0.5～5.0％、0.5％、0.8％、1.0％、2.0％或5.0％。
由上述的制备方法制备得到的β-葡聚糖溶液，也在本发明的保护范围内。其中，0.5％浓度的β-葡聚糖溶液粘度可以达到600mpa·s，透光率可以达到90％以上；0.8％浓度的β-葡聚糖溶液粘度可以达到1600mpa·s，透光率可以达到85％以上。
本发明具有如下有益效果：
(1)未使用酶解工艺，成本较低。
(2)未使用酸解或碱解工艺，不会对β-葡聚糖的功能性结构造成破坏。
(3)设备及材料简单常见，工艺简便易行，适于工业化。
(4)本法制得的β-葡聚糖溶液粘度大，透光率高，适于各种应用。
(5)本法制得的β-葡聚糖干品水溶性强，溶解后得到的β-葡聚糖溶液粘度大，透光率高。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的发酵液通过如下步骤制备得到：
(1)裂褶菌菌种活化：将马铃薯200g/l、葡萄糖30g/l、氯化钠10g/l、琼脂20g/l制成平板培养基，把裂褶菌菌种接种到该平板培养基上，于25℃恒温培养箱内培养7天得到平板菌丝体；
(2)种子活化：将马铃薯淀粉100g/l、葡萄糖40g/l、酵母浸膏2g/l、酵母浸粉2g/l、水制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/3，取步骤(1)所得的平板菌丝体接种该摇瓶，于25℃恒温摇床内160rpm震荡培养培养7天，作为种子液；
(3)发酵培养：将葡萄糖50g/l、蔗糖50g/l、黄豆粉5g/l、酵母浸粉2g/l、磷酸二氢钾0.5g/l、七水合硫酸镁0.5g/l、硫酸铵0.5g/l、硝酸钾6g/l、水制成的发酵培养基加入发酵罐中121℃灭菌15分钟，再将步骤(2)所得的种子液接种上述发酵罐中，25℃恒温300rpm搅拌4lpm通气发酵培养8天。
下述实施例中的负压过滤机真空泵购自autoscience，型号为ap-9925。scp-321#滤板购自沈阳长城过滤纸板有限公司。
下述实施例中，β-葡聚糖溶液的浓度的测定采用常规硫酸苯酚法和megazyme公司β-葡聚糖专用检测试剂盒(β-glucanassaykit(yeast&mushroom))。
下述实施例中β-葡聚糖溶液的透光率的测定方法如下：
(1)取β-葡聚糖溶液样品置于玻璃比色皿中；
(2)使用分光光度计，将检测波长调节至600nm；
(3)检测β-葡聚糖溶液样品在该波长下的透光率；
动力粘度的测定方法如下：
(1)取200mlβ-葡聚糖溶液样品置于250ml烧杯中；
(2)将盛有β-葡聚糖溶液样品的烧杯置于水浴锅中，25℃保温；
(3)使用旋转粘度计，根据β-葡聚糖溶液样品浓度选择对应转子，检测25℃下其动力粘度。
实施例1、纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液
按照如下步骤纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液：
(1)将裂褶菌发酵液与4倍体积的蒸馏水混合，60℃下浸煮8h。
(2)将浸煮液在4000rpm离心5min，取上清液；将上清液用300目的滤布负压过滤，取滤出清液待用。
(3)将步骤(2)过滤后的浸煮液加热至50℃，向其中同时加入200目的木质活性炭及8～16目的椰壳活性炭，每种活性炭的添加体积为浸煮液体积的1％。于50℃，350rpm条件下持续搅拌4h，冷却后待用；将上述冷却待用的混合有活性炭的浸煮清液，依次使用300目滤布及scp-321#滤板(孔径大小约1.5μm)进行负压抽滤，取过滤后的清液待用。
(4)将步骤(3)过滤后的清液与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：3)，搅拌，直至β-葡聚糖析出。
(5)将步骤(4)得到的析出物置于带孔托盘中，使用电热烘箱40℃烘干，直至恒重，得干燥的β-葡聚糖。
(6)将步骤(5)得到的β-葡聚糖干燥物粉碎，称取粉碎物5g，溶解于1000ml超纯水中，维持600rpm搅拌2h，直至β-葡聚糖充分溶解，得β-葡聚糖溶液；将上述β-葡聚糖溶液使用5μm滤膜进行负压抽滤，即可得到浓度为0.5％的高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液。
该质量浓度为0.5％的β-葡聚糖溶液在600nm波长下的透光率可以达到92.2％，动力粘度可以达到710mpa·s(2#转子30rpm)。
实施例2、纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液
按照如下步骤纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液：
(1)将裂褶菌发酵液与1倍体积的蒸馏水混合，90℃下高温浸煮0.5h。
(2)将步骤(1)得到的裂褶菌发酵浸煮液3000rpm离心60min，取上清液；上清液中加入2％硅藻土后，用300目的滤布负压过滤，取滤出清液待用。
(3)在步骤(2)过滤后的浸煮液中，加入浸煮液体积的2％的200目木质活性炭，300rpm室温搅拌5min，至搅拌均匀后，于4℃静置16h；将上述含有活性炭的混合液，依次使用300目滤布及scp-321#(孔径大小约1.5μm)滤板进行负压抽滤，取过滤后的清液待用。
(4)将步骤(3)过滤后的清液与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：1)，并搅拌，直至β-葡聚糖析出。向上述析出物中加入适量纯水并补充至总体积达到醇析前清液的体积，持续搅拌直至醇析物充分溶解。将溶解后的β-葡聚糖溶液再次与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：2)，搅拌，直至β-葡聚糖析出。将β-葡聚糖析出物转移至新的95％浓度的食用乙醇中，浸泡过夜，得到乙醇洗涤后的β-葡聚糖析出物。
(5)将步骤(4)得到的析出物置于托盘中，置于电热烘箱中40℃干燥，直至恒重，得β-葡聚糖干燥物。
(6)将步骤(5)得到的β-葡聚糖干燥物粉碎，称取粉碎物8g，溶解于1000ml预加热至40℃的超纯水中，维持600rpm搅拌4h，直至β-葡聚糖充分溶解，得β-葡聚糖溶液；使用10μm滤膜进行负压抽滤，即可得到浓度为0.8％的高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液。
该质量浓度为0.8％的β-葡聚糖溶液在600nm波长下的透光率可以达到90.0％，动力粘度可以达到2480mpa·s(4#转子30rpm)。
实施例3、纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液
按照如下步骤纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液：
(1)将裂褶菌发酵液与5倍体积的自来水混合，70℃下高温浸煮4h。
(2)将步骤(1)得到的裂褶菌发酵浸煮液，使用8层纱布进行负压过滤，取滤出清液。
(3)在步骤(2)过滤后的浸煮液中加入200目的木质活性炭及8～16目的椰壳活性炭，每种活性炭的添加体积为浸煮液体积的0.75％。300rpm室温搅拌5min至活性炭分布均匀后，将混合液加热至50℃，并于50℃保温静置4h；之后依次使用300目滤布及scp-321#滤板(孔径大小约1.5μm)进行负压抽滤，取过滤后的清液待用。
(4)将步骤(3)过滤后的清液与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：5)，搅拌，直至β-葡聚糖析出，将析出物捞起，待用。
(5)将步骤(4)得到的析出物置于带孔托盘中，使用电热烘箱50℃烘干，直至恒重，得干燥的β-葡聚糖。
(6)将步骤(5)得到的β-葡聚糖干燥物粉碎，称取10g，溶于1000ml超纯水中，制得β-葡聚糖溶液，然后在121℃高压蒸汽灭菌30min，静置冷却，待用；将上述灭菌后的β-葡聚糖溶液隔水加热至80℃，600rpm搅拌6h，直至β-葡聚糖充分溶解；再使用300目滤布进行负压抽滤，即可得到浓度为1.0％的高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液。
该质量浓度为1.0％的β-葡聚糖溶液在600nm波长下的透光率可以达到81.1％，动力粘度可以达到3100mpa·s(4#转子30rpm)。
实施例4、纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液
按照如下步骤纯化制备高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液：
(1)将裂褶菌发酵液与10倍体积的自来水混合，50℃下高温浸煮2h。
(2)将步骤(1)得到的裂褶菌发酵液浸煮液，5000rpm离心10min，取上清液待用。
(3)在步骤(2)离心分离后的浸煮液中加入300目的活性炭，添加体积为浸煮液体积的2.5％。300rpm，室温搅拌5min后，加热至80℃，并于80℃保温静置4h，期间每30min间歇搅拌一次；将向上述混有活性炭的浸煮清液中，加入0.5％的硅藻土，混匀后依次使用300目滤布及scp-321#滤板(孔径大小约1.5μm)进行负压抽滤，取过滤后的清液待用。
(4)将步骤(3)过滤后的清液与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：10)，搅拌，直至β-葡聚糖析出。将上述析出物溶于与析出物相同体积的纯水中，80℃下持续搅拌直至醇析物充分溶解。将溶解后的β-葡聚糖溶液再次与95％浓度的食用乙醇混合(体积比为1：1)，搅拌，直至β-葡聚糖析出。
(5)将步骤(4)得到的析出物置于带孔托盘中，使用电热烘箱60℃干燥，直至恒重，得干燥的β-葡聚糖。
(6)将步骤(5)得到的β-葡聚糖干燥物粉碎，称取粉碎物5g与8g，分别溶于1000ml超纯水中，然后在115℃高压蒸汽灭菌20min；将上述灭菌后的β-葡聚糖溶液隔水加热至70℃，维持800rpm搅拌4h，直至β-葡聚糖充分溶解；再使用10μm滤膜进行真空抽滤，即可分别得到浓度为0.5％及0.8％的高粘度、高透光率的β-葡聚糖溶液。
该质量浓度为0.5％的β-葡聚糖溶液在600nm波长下的透光率可以达到93.1％，动力粘度可以达到740mpa·s(2#转子30rpm)；质量浓度为0.8％的β-葡聚糖溶液在600nm波长下的透光率可以达到87.5％，动力粘度可以达到2150mpa·s(2#转子30rpm)。