本发明涉及多肽提取技术领域，具体是一种来源于厚壳贻贝闭壳肌的降压肽。
背景技术：
高血压是对人类健康危害严重的一种疾病，也是引起心血管疾病的主要因素，其危害是造成脑、心、肾等重要器官的损害。脑卒中和冠心病是高血压最严重的并发症。资料表明，世界各国的平均发病率为10% ～ 20%，每年因高血压死亡的人数达1200 万。目前，我国现有高血压患者已超过1.2 亿人口。因此，治疗和预防高血压病是当今社会十分重要的课题。
现阶段高血压病的医学研究主要集中在ACE 的抑制物质（ACEI）方面。目前，大多用化学合成的ACEI 如卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、赖诺普利(Listinopril) 等药物来治疗高血压。这类药物具有作用时间短，停药后血压易反弹等缺点，以及引起咳嗽、味觉丧失、肾脏损伤及血管神经性水肿等副作用。血管紧张素源（RAS）和激肽源（KXS）在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，而血管紧张素转化酶（ACE）则对两者起到调控作用，现在科学研究普遍认为，ACE 过高是导致高血压病的根本病因。所以要从根本上控制甚至治疗高血压病，必须要从一定程度上抑制ACE 的分泌。由于海洋生态环境的特殊性（如高压、低温等），使得贻贝闭壳肌蛋白质具有多种特异性氨基酸的组成和序列，贻贝闭壳肌蛋白质水解后暴露出降压的活性位点，从而使贻贝闭壳肌活性肽具有降压效果。同时，贻贝闭壳肌蛋白活性肽具有低抗原性的特点，安全性高，无毒副作用。因此贻贝闭壳肌蛋白质是制备降压肽的重要药源，贻贝闭壳肌降压肽的开发将成为高血压非药物治疗的重要组成部分。
制备活性肽的方法主要有：直接提取、体外降解和利用重组DNA 技术、酶法或化学法合成活性肽。体外水解蛋白质制备活性肽有三条工艺路线：酸水解、碱水解和酶法水解。前二者方法简单，但存在营养和毒理方面的有害效应，因此在食品加工中的应用受到了极大的限制。蛋白质的酶法水解一般不会导致营养方面的损失，也不会产生毒理上的问题；同时酶作用具有特异性，可在温和的条件下进行，能耗也低，所以酶法水解在食品加工中经常应用。
现有技术如授权公告号为CN102286590B的中国发明专利，公开了一种海蜇降压肽的制备方法，包括：对海蜇的去金属离子处理，并依次进行匀浆、酶解、灭酶、浓缩、超滤及冷冻干燥等步骤，最终获得纯化的海蜇降压肽粉末。本方法结合现代酶工程技术，提供了一种新的高效的海蜇降压肽的生产途径，提高了海蜇资源的利用效率，具有操作简单、提取率高、产物活性保存好的特点，海蜇降压肽生产成本降低。其充分利用海蜇丰富的蛋白质资源，通过去金属离子处理将海蜇体内各种金属离子基本去除干净，使后续酶解和应用更加安全。用高血压SHR 大鼠模型进行海蜇降压肽降压活性试验结果显示：该方法组与空白对照组相比差异有显著性，本方法制备的海蜇降压肽具有与阳性对照卡托普利相似的降血压活性。该方法只采用一种蛋白酶进行酶解，酶解不充分，且醇沉会使一部分降压肽失去活性，最后得到的降压肽活性不高。现有技术如授权公告号为CN102251003B的中国发明专利，公开了一种海洋生物源降压肽的制备工艺，它包括如下步骤：（1）预处理海洋生物副产品，除掉海洋生物副产品的表面杂质和脂肪；（2）酶法提取海洋生物源蛋白质；（3）膜分离的工艺技术分离纯化提取液，得到海洋生物源蛋白质；（4）蛋白酶酶解海洋生物源蛋白质，酶解结束后灭酶，得到海洋生物源降压肽溶液；（5）喷雾干燥快速干燥海洋生物源降压肽溶液，得到蛋白质含量大于90％的海洋生物源降压肽粉成品。采用上述工艺后，所制得海洋生物源降压肽成本低、降压活性高，平均相对分子量低、纯度高，并充分利用了海洋生物副产品，变废为宝，适合大规模工业化生产。该方法需要用到碱液和酸液，会产生酸碱废水，对环境不友好；蛋白酶中没有添加酶激活剂，酶解效率有待提高。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种分子量小，纯度高，活性强的来源于厚壳贻贝闭壳肌的降压肽，其制备方法酶解充分，提取率高，操作简单。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种来源于厚壳贻贝闭壳肌的降压肽，具体操作步骤：
1）预处理：将厚壳贻贝闭壳肌取出，用清水清洗3~5次，高速匀浆，按料液体积比1:20~40加入去离子水，浸泡时间为0.5~1.2h，搅拌，搅拌速率为200~400r/min，过滤。通过高速匀浆将厚壳贻贝闭壳肌细胞破坏，让细胞中的物质流出。无机盐、金属离子和其他小分子溶于水的杂质溶解在去离子水中，油脂漂浮在水面上，通过过滤，将这些杂志去除；
2）酶解：在沉淀中加入复合酶制剂，复合酶制剂按与底物质量比1:200~1:400加入，复合酶制剂成份及其重量份为：10~15份胰蛋白酶，6~10份中性蛋白酶，5~8份木瓜蛋白酶，0.002~0.008份氯化钙，0.001~0.005份半胱氨酸，0.0004~0.0009份棕榈炔酸，0.0008~0.0014份十二烷基硫酸钠和10~20份蒸馏水。酶解温度为40~55℃，pH为6.2~7.8，酶解时间为0.8~2.5h。不使用强酸强碱，酶解条件温和，节省能源，不会破坏降压肽活性；酶解具有高效性和专一性的特点，大大缩短了制备时间，且不会造成蛋白质流失；采用复合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人体吸收。酶解结束后沸水浴灭酶，灭酶时间为5~15min，过滤；
3）超滤：将得到的滤液注入离心超滤管，离心超滤管上的超滤膜为2000~4000Da，离心，离心速度为4000~8000r/min，取出内管的目的蛋白。使用离心超滤管不会有浓度梯度，分离速度快，且不会造成蛋白质的流失，脱盐效果好，降压肽提取率高；
4）纯化：在得到的目的蛋白中按料液体积比1:10~20加入蒸馏水，超滤，超滤膜为30~50KD，施加的压力为0.2~0.6Mpa。可有效去除分子量大于30~50KD的其他蛋白质，对降压肽进一步纯化，得到的降压肽纯度高；
5）干燥：将得到的滤出液真空冷冻干燥，真空冷冻干燥分为五个阶段，第一阶段，正常大气压，温度为1~5℃，时间为2~8h；第二阶段，真空度为0.002~0.005Kpa，温度为-10~-3℃，时间为3~6h；第三阶段，真空度为-0.008~-0.002Kpa，温度为-50~-60℃，时间为10~20h；第四阶段，真空度为0.004~0.006 Kpa，温度为-2~4℃，时间为5~12h；第五阶段，真空度为0.03~0.08 Kpa，温度为6~12℃，时间为1~4h。将得到的块状物质粉碎成粉末，得到纯度高，活性强的降压肽粉末。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过去离子水浸泡，去除无机盐、金属离子、其他小分子溶于水的杂质和油脂；不使用强酸强碱，酶解条件温和，节省能源，不会破坏降压肽活性；酶解具有高效性和专一性的特点，大大缩短了制备时间，且不会造成蛋白质流失；采用复合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人体吸收；使用离心超滤管提取降压肽，不会有浓度梯度，分离速度快，且不会造成蛋白质的流失，脱盐效果好，降压肽提取率高；再次超滤，可有效去除分子量大于30~50KD的其他蛋白质，对降压肽进一步纯化，得到的降压肽纯度高；本发明操作步骤简单，生产工艺先进，产品质量可控，成本低廉，经济效益高。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种来源于厚壳贻贝闭壳肌的降压肽，具体操作步骤：
1）预处理：将厚壳贻贝闭壳肌取出，用清水清洗3~5次，高速匀浆，按料液体积比1:20~40加入去离子水，浸泡时间为0.5~1.2h，搅拌，搅拌速率为200~400r/min，过滤。通过高速匀浆将厚壳贻贝闭壳肌细胞破坏，让细胞中的物质流出。无机盐、金属离子和其他小分子溶于水的杂质溶解在去离子水中，油脂漂浮在水面上，通过过滤，将这些杂志去除；
2）酶解：在沉淀中加入复合酶制剂，复合酶制剂按与底物质量比1:200~1:400加入，复合酶制剂成份及其重量份为：10~15份胰蛋白酶，6~10份中性蛋白酶，5~8份木瓜蛋白酶，0.002~0.008份氯化钙，0.001~0.005份半胱氨酸，0.0004~0.0009份棕榈炔酸，0.0008~0.0014份十二烷基硫酸钠和10~20份蒸馏水。酶解温度为40~55℃，pH为6.2~7.8，酶解时间为0.8~2.5h。不使用强酸强碱，酶解条件温和，节省能源，不会破坏降压肽活性；酶解具有高效性和专一性的特点，棕榈炔酸、十二烷基硫酸钠提高了酶解效果，大大缩短了制备时间，且不会造成蛋白质流失，提高产率；采用复合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人体吸收。酶解结束后沸水浴灭酶，灭酶时间为5~15min，过滤；
3）超滤：将得到的滤液注入离心超滤管，离心超滤管上的超滤膜为2000~4000Da，离心，离心速度为4000~8000r/min，取出内管的目的蛋白。使用离心超滤管不会有浓度梯度，分离速度快，且不会造成蛋白质的流失，脱盐效果好，降压肽提取率高；
4）纯化：在得到的目的蛋白中按料液体积比1:10~20加入蒸馏水，超滤，超滤膜为30~50KD，施加的压力为0.2~0.6Mpa。可有效去除分子量大于30~50KD的其他蛋白质，对降压肽进一步纯化，得到的降压肽纯度高；
5）干燥：将得到的滤出液真空冷冻干燥，真空冷冻干燥分为五个阶段，第一阶段，正常大气压，温度为1~5℃，时间为2~8h；第二阶段，真空度为0.002~0.005Kpa，温度为-10~-3℃，时间为3~6h；第三阶段，真空度为-0.008~-0.002Kpa，温度为-50~-60℃，时间为10~20h；第四阶段，真空度为0.004~0.006 Kpa，温度为-2~4℃，时间为5~12h；第五阶段，真空度为0.03~0.08 Kpa，温度为6~12℃，时间为1~4h。将得到的块状物质粉碎成粉末，得到纯度高，活性强的降压肽粉末。
实施例2：
一种来源于厚壳贻贝闭壳肌的降压肽，最优选操作步骤：
1）预处理：将厚壳贻贝闭壳肌取出，用清水清洗4次，用粉碎机粉碎，高速匀浆，速率为3000r/min。按料液体积比1:30加入去离子水，浸泡时间为1.0h，搅拌，搅拌速率为280r/min，过滤。通过高速匀浆将厚壳贻贝闭壳肌细胞破坏，让细胞中的物质流出。无机盐、金属离子和其他小分子溶于水的杂质溶解在去离子水中，油脂漂浮在水面上，通过过滤，将这些杂质去除；
2）酶解：在沉淀中加入复合酶制剂，复合酶制剂按与底物质量比1:250加入，复合酶制剂成份及其最优选重量份为：14份胰蛋白酶，8份中性蛋白酶，6份木瓜蛋白酶，0.006份氯化钙，0.004份半胱氨酸，0.0006份棕榈炔酸，0.0012份十二烷基硫酸钠和15份蒸馏水。酶解温度为50℃，pH为7.0，酶解时间为1.5h。不使用强酸强碱，酶解条件温和，节省能源，不会破坏降压肽活性；酶解具有高效性和专一性的特点，大大缩短了制备时间，且不会造成蛋白质流失；采用复合酶水解，酶解充分，得到的分子量小，易被人体吸收。酶解结束后沸水浴灭酶，灭酶时间为10min，过滤；
3）超滤：将得到的滤液注入离心超滤管，离心超滤管上的超滤膜为3000Da，离心，离心速度为5000r/min，取出内管的目的蛋白。使用离心超滤管不会有浓度梯度，分离速度快，且不会造成蛋白质的流失，脱盐效果好，降压肽提取率高；
4）纯化：在得到的目的蛋白中按料液体积比1:15加入蒸馏水，超滤，超滤膜为40KD，施加的压力为0.4Mpa。可有效去除分子量大于40KD的其他蛋白质，对降压肽进一步纯化，得到的降压肽纯度高；
5）干燥：将得到的滤出液真空冷冻干燥，真空冷冻干燥分为五个阶段，第一阶段，正常大气压，温度为4℃，时间为6h；第二阶段，真空度为0.004Kpa，温度为-8℃，时间为5h；第三阶段，真空度为-0.006Kpa，温度为-55℃，时间为18h；第四阶段，真空度为0.005 Kpa，温度为-1℃，时间为9h；第五阶段，真空度为0.07 Kpa，温度为10℃，时间为2h。将得到的块状物质粉碎成粉末，得到纯度高，活性强的降压肽粉末。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
步骤2中复合酶制剂与底物质量比不仅限于1:200~1:400，还包括1:205或1:210或1：215，……，或1:390或1:395或1:400。
步骤3中离心超滤管的超滤膜规格不仅限于2000~4000Da，还包括2005 Da或2010 Da或2015 Da，……，或3990 Da或3995 Da或4000 Da。
步骤4中超滤膜的规格不仅限于30~50KD，还包括30.005 KD或30.01 KD或30.015 KD，……，或49.990 KD或49.995 KD或50.000 KD。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。