本发明涉及一种植物化合物单体的制备方法，尤其的，涉及一种异紫花前胡内脂单体的分离纯化方法，属于中药化合物单体的分离纯化技术领域。
背景技术：
羌活（Rhizoma et Radix Notopterygii）为伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang 或宽叶羌活 Notopterygium forbesii Boiss.的干燥根茎及根。羌活性温味苦、辛，入膀胱、肾经，具有散表寒去风湿，利关节之功效，治外感风寒、头痛无汗、风寒湿痹、项强筋急、骨节酸痛、风水浮肿、痛肿疮毒等。
异紫花前胡内脂英文名为Marmesin，分子式为C14H14O4，分子量为246.09，结构式如下：
异紫花前胡内脂来源于伞形科羌活属植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang的干燥根茎。目前主要采用硅胶柱层析和结晶相结合的方法进行异紫花前胡内脂单体的精制，生产周期长，试剂浪费严重，产品收率低。
国家知识产权局于2004年07月28日公开了一种公开号为CN1515523，专利名称为“用树脂法从山杏叶中提取异黄酮、黄酮类、内脂的方法”的发明专利，其制备主要步骤：先将山杏叶以料液体积比1∶10-20比例、甲醇或乙醇浓度70-90%、浸出温度在20-60℃条件下，充分搅拌浸泡；调整料液的固形物浓度为1.5-3%，用氧化钙或用碱式硫酸铝调整pH值，净化沉淀；继续浓缩至固形物浓度达50%以上，得出异黄酮，喷雾干燥得出纯度80%以上的异黄酮；将非极性树脂流出的内脂用反渗透浓缩至料液的固形物达到干燥的标准，可得出纯度90%以上内脂成品。
该技术方案中，原料来源广阔，采集成本低，制备方法科学简单，其制备的有效物质可对动脉血管、心肌梗塞、脑血栓、骨质疏松、缓解妇女更年期、治疗乳腺癌等具有治疗作用。但该技术方案工艺复杂，工艺参数要求严格，同时分离出的内酯类物质含量低，纯度不高，不能满足市场需要；直接采用提取、分离异紫花前胡内脂，提取液中存在较多目标化合物异紫花前胡内脂的异构体，且为手性异构体。手性异构体通过传统的方法进行分离纯化极其苦难，成本高，单体纯度低。
技术实现要素：
本发明旨在解决现有技术问题，而提出了一种异紫花前胡内脂单体的分离纯化方法。本技术方案通过以羌活根茎为原料，通过提取、萃取、大孔树脂柱层析、硅胶柱层析及制备型高效液相色谱法等步骤，得到异紫花前胡内脂单体。本方法分离效率高，生产周期短，操作简便，成本低廉，可实现大量异紫花前胡内脂单体的纯度达99%以上分离制备。
一种异紫花前胡内脂单体的分离纯化方法，以羌活根茎为原料，通过提取、萃取、大孔树脂富集解析、硅胶柱层析及制备型高效液相色谱法等步骤，分离得到高纯度的异紫花前胡苷，异紫花前胡苷酸水解得到异紫花前胡内脂单体。
一种异紫花前胡内脂单体的分离纯化方法，包括以下步骤：
A.提取
将羌活根茎粉碎成1～4mm的粗粉，然后按照每千克原料加入95％乙醇溶液6-10升，提取3～4次， 2～3小时/次，回收乙醇，合并提取液，为提取液Ⅰ；
B.萃取
将步骤A所得的提取液Ⅰ，加入等体积的乙酸乙酯，萃取3～4次，收集萃取下层水溶液，得提取液Ⅱ；然后回收萃取乙酸乙酯层，回收后的乙酸乙酯再利用；
C.大孔树脂富集解析
将步骤B所得的提取液Ⅱ，用已活化的大孔树脂柱富集，富集完成后，用去离子水洗、80%乙醇解析，所得解析液回收乙醇，得提取液Ⅲ；
D. 硅胶柱层析
将步骤C所得的提取液Ⅲ用纯甲醇溶液溶解，溶解液用60-80目硅胶拌样，然后干燥；将干燥后的拌样原料上利用硅胶层析柱分离，采用氯仿：甲醇（V/V）8：2洗脱并收集产品；收集产品段回收有机试剂后，所得浓缩液用甲醇重结晶，结晶固体干燥后，待下一步处理；
在洗脱过程中，进行TLC检测，确保收集产品是否完全；TLC点板条件为硅胶G薄层板；以氯仿-甲醇展开剂，两者体积比为8比2，在365nm的紫外灯下检视显蓝色荧光斑点；
E.制备型高效液相色谱分离
将步骤D所得的结晶固体，用流动相溶解，过滤，滤液采用填料为C18制备型高效液相色谱分离，收集目标产品段；收集产品同时通过填料同样为C18分析HPLC紫外检测，确认收集目标化合物制备溶液检测波长为330nm；
所述制备型高效液相色谱采用填料为C18的色谱柱，制备流动相组成为四氢呋喃-水，两者体积比为20比80；
F.异紫花前胡苷产品回收
将步骤E所得的异紫花前胡苷制备液，回收流动相，再用C18填料富集，90%甲醇溶液解析，所得解析液回收甲醇后，浓缩液有大量白色固体析出，过滤，干燥，即得高纯度的异紫花前胡苷固体；
G.酸水解
将步骤F所得的异紫花前胡苷固体，用甲醇溶液溶解后，再加入10%盐酸溶液，加热回流2-3h，水解完成后，加入NaOH溶液调pH值至中性,再在50℃下减压浓缩至无醇，后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干，即得异紫花前胡内脂单体。
在步骤D中，硅胶柱填料为200～300目硅胶，流动相为乙酸乙酯-甲醇溶液，两者体积比为4比1。
在步骤E中，色谱柱填料为C18填料，流动相为四氢呋喃-水，两者体积比为20比80，紫外检测波长为330nm。
在进行酸水解前，通过填料为C18的HPLC检测，异紫花前胡苷纯度大于99%后，再进行酸水解，得到高纯度的异紫花前胡内脂。
此外，在进行高效制备液相色谱分离前，可通过液-质联用或其它本技术领域常用的方法确定高效液相色谱中异紫花前胡苷单体的峰形。
以液-质联用方法为例，可与上述制备分离色谱条件相同，采用填料相同的色谱柱、组成相同的流动相、相同的检测波长等，柱温为室温（无特别要求，室温即可）； 取步骤（D）所得的滤液进样，进行异紫花前胡苷单体的高效液相分离纯化，根据质谱检测结果，可确定异紫花前胡苷单体在液相色谱中所对应的峰形。
采用上述技术方案，带来的有益技术效果为：
（1）本发明通过适宜的工艺参数及条件，使产品中异紫花前胡内脂的含量达到99%以上；整个工艺过程稳定、操作简便、分离效率高，成本低廉，可大量高纯度分离制备异紫花前胡内脂单体；
（2）在本发明中，采用制备型高效液相色谱系统对异紫花前胡苷单体进行分离纯化，达到了很好的分离效果，并且通过在线紫外检测，针对性的收集异紫花前胡苷单体，目标明确；而且便于控制产品质量，产品纯度可达99%以上；通过制备得到的高纯度异紫花前胡苷，可以直接用酸水解，水解后只需将水解液中的酸、盐等其它杂质去除，即可得到高纯度的异紫花前胡内脂单体；
（3）在本发明中，针对羌活中存在各种成分的理化性质，本技术方案通过前述步骤的适当顺序搭配，以及适当的参数组合，有效提取出了异紫花前胡苷成分，并除去了大量杂质，由此获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液，而不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约了生产成本；
（4）在本发明A步骤中，从提取率、溶剂毒性和成本上综合评估，乙醇相比其他溶剂在保证提取率的前提下，毒性更低、成本低廉；用95%乙醇提取能够保证目标成分和其它中等极性的目标成分的高提取率；
（5）在本发明B步骤中，以乙酸乙酯为萃取剂，乙酸乙酯相比较其它萃取剂毒性较低，成本低廉。能够最大程度将提取液中的目标成分和其它杂质成分分离，达到初步的分离效果；
（6）在本发明C步骤中，目标成分主要集中于萃取水溶液中，体积大，浓缩困难。通过前期实验，目标成分能够吸附于大孔树脂上，达到富集目的，同时能够去除糖类等大孔树脂不吸附的大极性成分；用80%乙醇解析，能够将目标成分完全解析的同时能够避免在大孔树脂上强吸附的成分解析下来；解析液浓缩阶段可以将浓缩液体积减至最小，方便后续处理；
（7）在本发明D步骤中，利用硅胶填料对不同化合物的吸附能力和分配系数的不同，进一步分离目标化合物周围的杂质。目标化合物纯度越高，有利于后续的结晶处理；
（8）在本发明E步骤中，制备型高效液相色谱分离，是由于所得结晶固体为混合物，且化合物结构相近；而利用C18填料可以高分离度、高效率、快速的制备出高纯度的目标化合物；
（9）在本发明F步骤中，以C18填料富集，是根据目标化合物在C18填料上的吸附能力较其它填料要好，而且C18富集的优点在于快速、高效，富集时间可以通过控制高压泵的流速来实现，简单方便。用90%甲醇对目标化合物解析能力强，解析彻底无残留。90%甲醇易于浓缩，浓缩液体积较小，目标物在浓缩液中析出比较完全；
（10）在本发明G步骤中，步骤F所得到的目标化合物为异紫花前胡苷，是异紫花前胡内脂与一个葡糖糖结合的苷类化合物，异紫花前胡内脂为苷元。所以要通过在酸性条件下将异紫花前胡苷的葡萄糖脱掉，才能得到异紫花前胡内脂。水解完成后，水解液中残余的盐酸需加入NaOH溶液中和，使水解液为中性条件。通过乙酸乙酯萃取将盐除去后，将乙酸乙酯浓缩干，即可得到异紫花前胡内脂固体；
（11）在本发明中，各工艺步骤中的有机试剂均可回收再利用，溶剂消耗量少，节约成本。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种异紫花前胡内脂单体的分离纯化方法，包括如下工艺步骤：
A.提取
将羌活根茎称取5Kg，粉碎成1～4mm的粗粉，加入10L体积浓度为95%乙醇溶液，提取3次， 2小时/次，回收乙醇，合并提取液，共2.9L，为提取液Ⅰ；
B.萃取
将步骤A所得的提取液Ⅰ，加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次，取下层水溶液，回收残余乙酸乙酯，所得浓缩液共1.8 L，得提取液Ⅱ；
C.大孔树脂柱层析
将步骤B所得的1.8 L提取液Ⅱ，用已活化的大孔树脂柱富集，富集完成后，分别用10L去离子水洗、15L体积浓度为80%乙醇解析，所得解析液回收乙醇，得浓缩液1L，为提取液Ⅲ；
D.硅胶柱层析
将步骤C所得的提取液Ⅲ用1L纯甲醇溶液溶解，溶解液用500g 60-80目硅胶拌样，然后干燥，再将干燥后的拌样原料上样，最后硅胶层析柱洗脱；
在此过程中，进行TLC检测，检测条件为：氯仿/甲醇=8/2，硅胶G板，365nm的紫外灯下检视显蓝色荧光斑点；收集目标化合物层析液，层析液回收有机试剂后，所得浓缩液用甲醇重结晶，结晶固体干燥后，总重15g；
E.制备型高效制备液相色谱分离
将步骤D所得的结晶固体，用1L流动相溶液溶解，过滤，滤液采用制备型高效液相色谱分离；并经过在线紫外检测，收集目标化合物制备溶液30L，即为异紫花前胡苷制备液；
F.异紫花前胡苷产品回收
将步骤E所得的30L异紫花前胡苷制备液，回收流动相，再用C18填料富集，10L体积浓度为90%甲醇解析，所得解析液回收甲醇后，浓缩液有大量白色固体析出，过滤，干燥，即得高纯度的异紫花前胡苷固体10g。
G.酸水解
将步骤F所得的10g异紫花前胡苷固体，用1.5 L甲醇溶液溶解后，再加入0.1L体积浓度为10%盐酸溶液，加热回流3h，水解完成后，加入NaOH溶液调pH值至中性，再在50℃条件下减压浓缩至无醇，后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干，得异紫花前胡内脂单体6g。
整个生产流程用时约5天。
计算得产品收率为（6.0/5000）×100%=0.12%。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.15%。
实施例2
一种异紫花前胡内脂单体的分离纯化方法，包括如下工艺步骤：
A.提取
将羌活根茎称取50Kg，粉碎成1～4mm的粗粉，加入110L体积浓度为95%乙醇溶液，提取3次，2小时/次，回收乙醇，合并提取液，共30L，为提取液Ⅰ；
B.萃取
将步骤A所得的提取液Ⅰ，加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次，取下层水溶液，回收残余乙酸乙酯，所得浓缩液共20L，得提取液Ⅱ；
C.大孔树脂柱层析
将步骤B所得的20L提取液Ⅱ，用已活化的大孔树脂柱富集，富集完成后，分别用80L去离子水洗、100L体积浓度为80%乙醇解析，所得解析液回收乙醇，得浓缩液5L，为提取液Ⅲ；
D.硅胶柱层析
将步骤C所得的提取液Ⅲ用2L纯甲醇溶液溶解，溶解液用4Kg 60-80目硅胶拌样，然后干燥，再将干燥后的拌样原料上样，最后硅胶层析柱洗脱；
在此过程中，进行TLC检测，检测条件为：氯仿/甲醇=8/2，硅胶G板，365nm的紫外灯下检视显蓝色荧光斑点；收集目标化合物层析液，层析液回收有机试剂后，所得浓缩液用甲醇重结晶，结晶固体干燥后，总重160g；
E.制备型高效制备液相色谱分离
将步骤D所得的结晶固体，用1L流动相溶液溶解，过滤，滤液采用制备型高效液相色谱分离；并经过在线紫外检测，收集目标化合物制备溶液80L，即为异紫花前胡苷制备液；
F.异紫花前胡苷产品回收
将步骤E所得的80L异紫花前胡苷制备液，回收流动相，再用C18填料富集，20L体积浓度为90%甲醇解析，所得解析液回收甲醇后，浓缩液有大量白色固体析出，过滤，干燥，即得高纯度的异紫花前胡苷固体100g。
G.酸水解
将步骤F所得的100g异紫花前胡苷固体，用3L甲醇溶液溶解后，再加入0.5L体积浓度为10%盐酸溶液，加热回流3h，水解完成后，加入NaOH溶液调pH值至中性，再在50℃条件下减压浓缩至无醇，后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干，得异紫花前胡内脂单体65g。
整个生产流程用时约7天。
计算得产品收率为（65/50000）×100%=0.13%。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.25%。
实施例3
一种异紫花前胡内脂单体的分离纯化方法，包括如下工艺步骤：
A.提取
将羌活根茎称取100Kg，粉碎成1～4mm的粗粉，加入250L体积浓度为95%乙醇溶液，提取4次， 3小时/次，回收乙醇，合并提取液，共70L，为提取液Ⅰ；
B.萃取
将步骤A所得的提取液Ⅰ，加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次，取下层水溶液，回收残余乙酸乙酯，所得浓缩液共50 L，得提取液Ⅱ；
C.大孔树脂柱层析
将步骤B所得的50L提取液Ⅱ，用已活化的大孔树脂柱富集，富集完成后，分别用100L去离子水洗、150L体积浓度为80%乙醇解析，所得解析液回收乙醇，得浓缩液12L，为提取液Ⅲ；
D.硅胶柱层析
将步骤C所得的提取液Ⅲ用5L纯甲醇溶液溶解，溶解液用6Kg 60-80目硅胶拌样，然后干燥，再将干燥后的拌样原料上样，最后硅胶层析柱洗脱；
在此过程中，进行TLC检测，检测条件为：氯仿/甲醇=8/2，硅胶G板，365nm的紫外灯下检视显蓝色荧光斑点；收集目标化合物层析液，层析液回收有机试剂后，所得浓缩液用甲醇重结晶，结晶固体干燥后，总重350g；
E.制备型高效制备液相色谱分离
将步骤D所得的结晶固体，用8L流动相溶液溶解，过滤，滤液采用制备型高效液相色谱分离；并经过在线紫外检测，收集目标化合物制备溶液100L，即为异紫花前胡苷制备液；
F.异紫花前胡苷产品回收
将步骤E所得的100L异紫花前胡苷制备液，回收流动相，再用C18填料富集，40L体积浓度为90%甲醇解析，所得解析液回收甲醇后，浓缩液有大量白色固体析出，过滤，干燥，即得高纯度的异紫花前胡苷固体220g。
G.酸水解
将步骤F所得的220g异紫花前胡苷固体，用3 L甲醇溶液溶解后，再加入0.5L体积浓度为10%盐酸溶液，加热回流3h，水解完成后，加入NaOH溶液调pH值至中性，再在50℃条件下减压浓缩至无醇，后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干，得异紫花前胡内脂单体140g。
整个生产流程用时约10天。
计算得产品收率为（140/100000）×100%=0.14%。
通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为99.18%。
实施例4
在实施例1-3基础上，在步骤D中，硅胶柱填料为：200～300目硅胶，流动相为乙酸乙酯-甲醇溶液，两者体积比为4比1。
在步骤E中，色谱柱填料为C18填料，流动相为四氢呋喃/水=20：80，紫外检测波长为330nm。
在进行酸水解前，通过HPLC检测，异紫花前胡苷纯度大于99%后，再进行酸水解，得到高纯度的异紫花前胡内脂。