一种高通量微藻生长测试装置的制作方法

本实用新型涉及光合微生物的培养和检测技术领域，具体是涉及一种高通量微藻的生长测试装置及方法。

背景技术：

微藻的培养测试是藻类学研究中必不可少的一环，在微藻生物能源，生态毒理学，水体富营养化，水体浮游生物群落结构等众多领域的研究中，一般通过设置正常对照组与处理组(如添加重金属等有毒有害成分；添加高含N、P量的污水；添加不同剂量营养盐；添加不同藻种；添加不同浮游生物等)，比较两组藻细胞的生长情况，测定藻生物量、油脂色素含量、光合效率、培养液成分等重要评价指标，为研究结论提供数据支撑。目前普遍通用的微藻培养方法是以锥形瓶做为培养容器，借助恒温光照培养箱控制培养温度和光密度，实现微藻培养。取样时，需于无菌操作台内操作，以降低感染细菌的可能性。

众所周知的，在生物实验中，往往需要对微生物或细胞生长特性、生态毒理反应进行测试，特别是针对突变株的筛选。在一般的微生物或细胞进行测试中，会用到孔板，孔板的规格有6、12、24、48、96孔，每个孔的容积依次是16.8ml、6.9ml、3.4ml、1.7ml、0.36ml。在一般的生物或细胞的生长特性测试、毒性反应测试实验中，孔板具有标准容积、生长面积等规格一致，一次性可以做几组到几十组平行实验，具有较高的测试通量；而且孔板的各孔培养体系小，不会浪费过多的培养基和生物材料以及耗费较多的培养时间等问题，因此适于标准化实验操作，使对照性实验数据也更加可靠、客观。

然而，锥形瓶与孔板皿的培养体系却有很多的不足：如无法供给二氧化碳等气源，培养体系细胞分散不均匀，生长速度缓慢；培养空间易受限制，对于数十毫升体系，单位空间设置组别数量有限，即通量低；各组别受光密度易不均匀，平行性差；取样繁琐，易感染细菌，培养体系不够稳定等等。不仅灵敏度不高，还消耗大量时间成本，远远无法满足现在对于微藻细胞的科研需求。例如中国专利授权公告号CN 103074205 B，其虽然也揭示了一种“一种电动转盘系统和微藻高通量筛选装置以及微藻的高通量筛选方法”，但其实质上还是先将微藻接种到微孔板中，再将微孔板板状卡槽3中，转动转盘，光照下培养，测量培养后微孔板中每孔的吸光度，将吸光度换算成对应的微藻细胞干重浓度，以此筛选微藻。该实用新型虽解决了光照和摇瓶问题，但是对于微藻细胞生长所需的CO₂，文中仅提到，在接种微藻到微孔板之前先封装2-50％体积的CO₂在微孔板中；可是微藻细胞很难耐受如此高浓度的CO₂，也无法及时排出阻碍光合反应器的O₂，故而也无法满足测试、筛选的要求。同时该公开的专利方案中，各个孔内培养量太小。只有0.1ml的藻液，不足以支撑例如干质量、光合作用效率、培养液TOC、TN有机物变化规律等很多重要参数的测量。其主要是基于96孔板的培养系统，单个孔为一个培养单元，和整个板是一体的，独立性差。主要表现在以下三个方面，其一，单个孔内二氧化碳不能灵活控制，同一个板多孔之间难以设置梯度；其二、单个培养单元不能独立完成边培养边检测操作，一旦取样，培养孔内二氧化碳就会发生改变，即使再封入二氧化碳，也已经和其他孔不平行了，不能再进行平行对照实验。此外，该专利中培养单元形状不可改变，不能用于研究反应器形状对于光利用效率的影响。

除了上述传统的培养方法，近年一些新型光生物反应器也被应用于微藻生物技术研究领域。这些新型的反应器偏向性各不相同，有的侧重于培养条件的灵活控制，如灵活选择光源，可输入各种气源及不同的曝气方式，可控制环境温度等；有的侧重于光的高效利用，通过设置反光装置，提高反应器的受光面积和受光强度；有的侧重于反应器封闭性，以提供一个无菌的培养环境。有的则设计为更利于培养物的收获，等等。这些新型的光催化、光生物反应器优势明显，对于研究微藻生长、反应很有帮助，也越来越多的被用于微藻生物的研究领域。

但是这些光生物反应器并没有体现出通量的重要性，普遍只能设置几组、十几组反应单元，且培养体系较大。随着微藻生物技术的快速发展，微藻培养测试在生态毒理学，水体富营养化，微藻生物能源等多个领域的应用更加广泛，低通量的反应器会大大增加研究的时间成本，阻碍了微藻生物技术的快速发展。并且目前的光反应器在平行性方面做了很多工作，却忽略了单个反应器单元的灵活调控，不足以支持更加复杂多变的实验研究。

技术实现要素：

本实用新型的技术目的是提供一种适于微藻的高通量生长和测试装置。其不仅保留了体系小，平行性高，应用范围广等诸多优点，还在高通量、灵活性、稳定性方面再做突破，实现1个立方米最多可进行1200组反应培养瓶的高通量设置，大大节约研究时间。可实现对单个反应培养瓶进行光照和供气的精确控制，帮助进行更为复杂多变的实验研究；通过注射器原位取样既能精确取样又能减少污染的风险，实现培养全过程反应体系恒定，提升结果的准确性。本实用新型可促进微藻生物技术快速发展，使其应用于更多科学领域。

为达到以上技术目的，本实用新型的技术方案是：

一种高通量微藻生长测试装置，包括培养架体、光源、CO₂或空气气源、数字型气体流量计、毫升级培养瓶、气体多阀分流调节器、以及气体过滤器；所述培养架体设有若干个用于容纳所述毫升级培养瓶的定位结构。

其中，所述毫升级培养瓶具有多孔瓶塞或多孔螺纹盖，在孔内塞有毫米级中空玻璃导气管和/或硅胶管。所述光源优选为LED灯、荧光灯、汞灯、白炽灯、节能灯。

其中，还可以包括一个光源和供气调节箱，所述光源和供气调节箱的两侧具有开口侧；在中间部位设置可向两开口侧发出光线的光源，在开口侧的左右内壁设置固定培养架体的支撑结构；光源和供气调节箱与CO₂或空气气源连接，设有气源调节阀，光源和供气调节箱设有光源光强调节钮。

其中，所述培养架体包括单排多孔架体或双排交错孔培养架体，每个孔内可放置小于100ml的培养瓶。

其中，所述培养架体(构成一个培养单元)包括单排多孔架体或双排交错孔培养架体，由两侧板和上、下板组成(亚力克材质，4个部分)，前后两侧开口；长50cm，宽8cm；上板大孔直径：3.7cm，共10孔，从左往右孔间间隔1cm(反应单元间隔1cm以降低彼此间对光的遮挡)，下板小孔径1cm。每个孔内可放置小于100ml(如50ml，30ml，10ml)的培养瓶；所述培养瓶底部呈锥形底部，其锥形底部的尖端对位于所述下板的小孔。单排多孔架体的规格是长*宽*高：0.5*0.2*0.5米。适配50ml、3.5cm光径培养瓶，光径很小，透光率高，微藻生长速度快，缩短研究时间。3.5cm光径培养瓶前后排交错可避免光源被前一排培养瓶挡住光照。

其中，所述毫升级培养瓶的多孔瓶塞或多孔螺纹盖包括至少3个孔，其中一个孔内密封套有微米级孔径硅胶管或带有一段可自闭合软管的硅胶管，硅胶管外端套设取样端口，优选的，取样端口是取样注射器的针头，无需打开培养瓶就可以轻松取样，可降低培养瓶内部环境受到污染的风险；另一个孔内塞有毫米级中空玻璃导气管，连接气体多阀分流调节器；第三个孔是以纳米级孔径细菌过滤膜封口，保证培养瓶内外气压平衡的同时阻止细菌等异源生物的污染。

其中，所述气体多阀分流调节器的主管一端通过软管连接CO₂或空气气源，主管外侧辐射状分布设置若干个带有独立阀门的分流管，这些分流管与一个橡皮管套接，这个橡皮管又与毫升级培养瓶上的毫米级中空玻璃导气管连接。气体多阀分流调节器可保证各个毫升级培养瓶的CO₂供应的均匀性，提高平行性实验的可靠度，和每个单独的培养瓶的可控性。

其中，所述气体过滤器设置在CO₂或空气气源和气体多阀分流调节器之间。气体过滤器的设置优选为：在供气的橡皮管上设置圆形的盒体，盒体内装有气体过滤器：橡皮管一端连接气源，一端连接到培养瓶上的毫米级中空玻璃供气管。该盒体可以分为两个可以拆分的盖体，在两个盖体之间安装一个微孔滤纸。

本实用新型的高通量微藻生长测试装置，还可以包括低通光学滤光片，所述低通光学滤光片罩设在毫升级培养瓶外。优选的，低通光学滤光片做成圆筒状，包围在毫升级培养瓶外侧。

本实用新型所取得的技术效果和技术优势是：

(1)高通量性：现有其他的常见微藻高通量微藻生长测试装置中，每个培养单元(当培养架体上装满培养瓶时组成一个培养单元)的培养体系达到升级，反应单元普遍仅有数个(5-6个)。本实用新型中大大缩小每个培养反应体系至毫升级，通过培养架体，重新设置反应单元空间排序为竖直三排或水平双排等，设定单个反应单元间距≥1厘米，可实现高通量培养测试。

例如，若反应器整体规格长*宽*高：0.5*0.2*0.5米，占用0.05立方米，对于50ml的培养体系，可设置60组平行样，基本满足99％以上的实验需求。若以LED点状灯为光源，1立方米至多可搭建20组反应器单元，最多可同时设置1200组平行样。对于小于50ml如30ml，10ml的培养体系，还可设置更多组，每个样品皆可通过气体多阀分流调节器单独控制通气量，并且可通过低通光学滤光片调节受光量子密度，具有很强的灵活性。通量方面相比于目前的微藻培养装置，提升了几个量级。应用范围广，可以应用于微藻生物能源，生态毒理学，水体富营养化，水体浮游生物群落结构等众多领域。

(2)研究时间缩短：将反应体系缩小到几至几十个毫升，节约样品用量；且较小的光径，会大大提升藻细胞生长速度，研究时间也会缩短。

(3)灵活调控性：现有多通量光反应器对于单个反应器单元并未有调控手段，本实用新型毫升级培养瓶规格多种可选，形状如圆柱、方形多种可选；通过气体多阀分流调节器对每个培养瓶都可独立控制通气量；光源可任意选择，如LED灯带或日光灯管都很匹配；通过滤光片可单独控制每个培养瓶的实际受光量子密度。

(4)平行性可靠度高：培养瓶位置按对称性原则设置，每个培养架体的各培养瓶光与气可控制的基本一致。

(5)培养环境稳定性：现有光反应器取样方式为开盖式与底漏式，本实用新型采用特制多孔螺旋塞结合注射器实现原位取样，增加体系无菌性能，保证反应体系稳定。灭菌培养瓶用于培养后，采用多孔螺旋塞加空气过滤器保证无菌环境，一个孔以毫米级中空玻璃管作为导气管，给培养液提供气源，另一孔插入微米级孔径硅胶管或带有一段可自闭合软管的硅胶管，硅胶管的端头可供衔接一个取样注射器或负压袋，取样时利用注射器或负压袋取样，不仅取样方便，还能减少开盖式取样带来的污染，从而保证整个培养时期培养环境稳定。其中第三个孔以纳米级孔径细菌过滤膜封口，保证培养瓶内正常大气压的同时阻止细菌等异源生物的污染，十分有利于无菌要求严格的实验研究。

(6)相对于专利CN 103074205 B而言，在相同培养基、光照强度、初始接种浓度下，由于可持续通入二氧化碳，而不是在反应前封装CO2进去，故可提供碳源及搅拌作用，最大生物量可达到4.2和4.8g/l，提高400％以上，相同光径条件下，还可更高。本装置在保留了高通量优点的同时，具有更大的培养体系(1ml-100ml)，能提供更多的测试样品同时用于生物量，光合作用效率，培养液TOC、TN有机物变化规律，阴阳离子、金属离子吸收效率，循环培养基作用效果等多种指标的测定等，不局限于藻种筛选，还可以应用于微藻生物能源，生态毒理学，水体富营养化，水体浮游生物群落结构等众多领域。本装置中还通过气体多阀分流调节器对每个培养瓶都可独立控制通气量，且每一个培养瓶都是完全独立的，培养瓶采用特制多孔螺旋塞，一孔以毫米级中空玻璃管作为导气管，给培养液提供气源，另一孔插入微米级孔径硅胶管，管头衔接注射器，利用注射器取样，培养过程中任何时间都可以取样，不会对培养环境有任何的干扰。本装置培养瓶可以是圆形也可以是方形和其他形状，可以用于研究反应器形状对于光的利用效率。

附图说明

图1为本实用新型较佳实施例的高通量微藻生长测试装置(不含供气调节箱)的结构示意图；

图2为图1所示实施例的带有光源的供气调节箱的结构示意图；

图3-图5为本实用新型的培养架体实施为单层单排、单层双排、多层单排的结构示意图；

图6为本实用新型图1所示实施例的毫升级培养瓶的结构示意图；

图7为本实用新型图1所示实施例的毫升级培养瓶上结合的带孔橡胶塞的结构示意图；

图8为本实用新型图1所示实施例的气体多阀分流调节器结构示意图；

图9为本实用新型图1所示实施例的位于进气管与气体多阀分流调节器之间的空气过滤器的结构示意图；

图10为本实用新型图1所示实施例与取样硅胶管的取样端口连接的注射器结构示意图；

图中：

11-气源；12-硅胶导管；13-空气过滤器；14-数字型气体流量计；15-气体多阀分流调节器；16-多孔橡胶塞：17-中空玻璃导气管；18-玻璃毫升级培养瓶；19-培养架体；191-上板的大孔；192-下板的小孔；20-取样注射器；21-管式光源；

22-供气调节箱；221-培养架体支撑结构；A-培养架体上板，B-培养架体下板；151-进气口；152-导气主管道；153-分流管；154-分流阀；131-空气过滤器接管；132-过滤片；201-可替换的取样针头。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本实用新型的内容，但不应理解为对本实用新型的限制。在不背离本实用新型精神和实质的情况下，对本实用新型方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本实用新型的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

结合图1-2所示，一种高通量微藻生长测试装置，包括光照和供气调节箱22，箱内设置有培养架体12、光源21、毫升级培养瓶18、气体多阀分流调节器15、CO₂或空气气源11以及气体过滤器13，所述气体过滤器13还连接数字型气体流量计14，以监测进入到气体多阀分流调节器15的气体流量。具体说明如下：

1)光源和供气调节箱22(如图2所示)：其两侧具有开口侧；在中间部位设置可向两开口侧发出光线的LED灯等管式光源21，在开口侧的左右内壁可设置固定培养架体的支撑结构221；光源和供气调节箱22与CO₂或空气气源11连接，设有气源调节阀和气体流量计14(如图1)，光源和供气调节箱22设有LED灯管光强调节钮(未示)。其中光源和供气调节箱22的主要作用是为了固定光源和供气装置，以及装设光源和供气装置的调节钮等。因此，光源和供气调节箱不是必须结构。

2)培养架体如图3-5所示(培养架体与内部固定的培养瓶构成一个培养单元):单层单排或单层双排多孔架体(如图3，4所示)或多层单排培养架体(如图5所示)，是由两侧板和至少一组上、下板A、B组成(亚力克材质，4个部分)，前后两侧开口；长50cm，宽8cm；上板A大孔191直径：3.7cm，共10孔，从左往右孔间间隔1cm(反应单元间隔1cm以降低彼此间对光的遮挡)，下板B小孔192径1cm。每组上下孔中心对齐的大孔191与小孔192内可放置一个小于50ml(如30ml，10ml)的玻璃毫升级培养瓶18。3.5cm光径培养瓶，通过双排多孔架体19的后一排的大孔191与前一排的大孔191的前后排交错/错位，可避免光源被前一排玻璃毫升级培养瓶18挡住光照。

对于图3所示的，单排单层的多孔架体19的规格是长*宽*高：0.5*0.2*0.5米。适配50ml、3.5cm光径培养瓶，光径很小，光透过率高，微藻生长速度快，可缩短研究时间。

3)玻璃毫升级培养瓶18(如图6、7所示)：玻璃毫升级培养瓶18，瓶口上设有的多孔橡胶塞或螺纹盖16，其包括至少3个孔，如图7所示的多孔橡胶塞16，其中一个孔内密封套有一个微米级孔径硅胶管162或具有一段能自闭合的软管的硅胶管162，硅胶管162的外端可供套设一个取样注射器20的针头201，该针头201与硅胶管162始终连接，或者仅在取样时临时连接，针头201可供取样注射器20连接；取样时，拉注射器20形成负压，无需打开培养瓶18就可以轻松取样(如图1和图10所示)，可控制培养瓶18的内部环境不易受到污染；另一个孔塞有毫米级中空玻璃导气管161，可供连接气体多阀分流调节器15的一个分流管153；多孔橡胶塞16的第三个孔(示意图见图7)，是以纳米级孔径细菌过滤膜封口，平衡培养瓶内正常大气压的同时阻止细菌等异源生物的污染。

在另一些实施方式中，所述微米级孔径硅胶管可替换为具有一段可自闭合软管的硅胶管162，硅胶管162底部插入培养瓶18中；在取样时，使用其他负压袋或者类似的负压装置与硅胶管162密闭对接，释放负压袋等负压装置，可实现自动取样，取样结束后直接拔掉负压袋，硅胶管的自闭合软管部分将自动闭合封口，实现无菌操作。

此外，培养瓶18自身可采用可挤压变形的透明材质制作成，如PC\PVC等，既可以满足光自养微生物的需求，又可以取样的时候，直接手握住培养瓶挤压，使样液冲开微米级孔径的硅胶管162，溢出样液。当松开挤压后，样液回流，微米级孔径的硅胶管162管壁自动黏合封闭，也可以实现无菌操作。

4)气体多阀分流调节器(如图8所示)(用气体多阀分流调节器提供CO2气体给微藻)的导气主管道152一端的进气口151通过软管连接CO2或空气气源(见图1左上)，导气主管道152的外侧沿轴向两侧均匀辐射状分布若干个设有独立阀门154的分流管153，这些分流管与一个橡皮管套接，这个橡皮管又与毫升级培养瓶18上的毫米级中空玻璃导气管161连接。气体多阀分流调节器15可保证各个毫升级培养瓶18的CO2供应的均匀性，提高平行性实验的可靠度，和每个单独的培养瓶18的可控性。

5)如图9所示，在供气的橡皮管道上设置空气过滤器13，其包括两个互相面对面相扣的漏洞形空气过滤器接管131，以及夹设再两个空气过滤器接管131之间的过滤片132，所述过滤片132包含至少一层微孔滤纸。

6)低通光学滤光片：

做成圆筒状，可包围在毫升级培养瓶18的外侧。

本实用新型的高通量微藻生长测试装置，是专门针对微藻的培养及测试而设计。若单个反应器单元(培养架体19和当每个孔内均固定一个毫升级培养瓶18组成一个反应器单元)整体规格长*宽*高：0.5*0.2*0.5米，占用空间0.05立方米。采用竖直三排，每排10个孔、水平双排平行排列方式，对于50ml的培养体系，可设置60组平行样。反应器以LED灯为光源，1立方米至多可搭建20组反应器单元，最多可同时设置1200组平行样。而对于小于50ml如30ml，10ml的培养体系，还可更多；每个样品皆可通过气体多阀分流调节器15单独控制通气量，并且可通过低通光学滤光片调节受光量子密度，具有很强的灵活性。

利用本实用新型的高通量微藻生长测试装置，可在同一批次实验中，设置不同藻细胞初始浓度、不同通气量、不同光密度梯度、不同营养因子浓度、理化因子测试等多种实验研究，大大缩短研究时间。高通量微藻生长测试装置还可以做到无菌培养，其中特制的三孔式橡胶塞16或螺旋塞(瓶盖)封住毫升级培养瓶18，一孔插入中空玻璃导气管161连接空气过滤器，另一孔以微米级孔径硅胶管162衔接注射器的针头201，以此方式取样避免开盖式取样带来的污染，保证培养体系的无菌性，对于毫升级培养体系而言，严密的无菌要求更显得至关重要；本实用新型的高通量培养测试装置同时也支持接入二氧化碳、氧气等各种气源。

上述高通量微藻生长测试装置的技术效果为：

(1)可根据气体流量计按需求设定CO2的供应量，可排出反应器中产生的O2，平衡内外气压，培养体系细胞分散更均匀；

(2)单个培养瓶的培养体系小，体系内微藻生长速度快，测试效率高，灵敏度较好，可节省大量的实验时间；

(3)提供平均光密度的光照条件和可控的供气条件，实验的平行性较好；

(4)自带取样口，方便取样，不易感染细菌，培养体系稳定；

(5)单位空间设置多组，具有高通量性；

(6)每个培养瓶(各个培养瓶)，可灵活调控。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。