细胞培养中的多个容器间的送液方法与流程

本发明涉及一种细胞培养技术，特别涉及使用多个培养容器和培养基供给容器时的容器间的送液方法。

背景技术：

近年来，在药品的生产、或基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工的环境下高效大量地培养细胞或组织、微生物等。在这样的细胞培养中，有时采用将多个容器用管道连接而构成封闭体系的环境、在这些多个容器间进行送液的方法。

具体而言，例如如下实行，即，将多个培养袋和培养基供给袋用管道连接，从培养基供给袋向培养袋移送培养基，在培养袋中培养细胞，将包含培养了的细胞及培养基的培养液(以下将包含细胞和培养基的液体称作培养液)移送到培养面积更大的培养袋，使细胞进一步增殖等。

此时，如果为了在多个袋间移送内容物，而在每个袋间设置泵，则能够高效地进行内容物的移送。然而，该方法中，存在有成本升高、并且需要复杂的控制机构和大量设备的问题。

另一方面，通过使管道分支，能够减少泵的台数。然而，该情况下，为了控制分支了的管道的流路，需要夹管阀等，仍然存在有需要复杂的控制机构和大量设备的问题。

在此，专利文献1中，公开过用于在自动细胞培养装置中使用的细胞培养用的容器组件。根据该细胞培养用组件，能够在维持封闭体系的同时进行细胞培养中的细胞的注入、培养基追加、取样、甚至回收。

专利文献1：国际公开2013/114845号小册子

技术实现要素：

发明所要解决的问题

然而，该细胞培养用组件并非为了简化细胞培养中的流路的控制机构而设计的组件。因此，在控制多个容器间的流路时，需要使用1个或多个泵，并且使用多个夹子，存在有流路的控制机构略为复杂的问题。

因而，本发明人等进行了深入研究，将多个容器用三通阀连接，并且将培养容器依送液的顺序设置落差地配置，由此成功地仅使用1台泵来简便地控制流路，从而完成了本发明。

根据这样的本发明，可以利用泵进行从培养基供给容器向培养容器的培养基的移送，利用自然送液进行多个培养容器间的培养液的移送。另外，可以不需要夹管阀、夹子等，能够大幅度简化控制机构。

本发明是鉴于上述事情而完成的，目的在于，提供一种细胞培养中的多个容器间的送液方法，该方法能够简化使用多个容器进行细胞培养时的容器间的流路控制。

用于解决问题的方法

本发明的细胞培养中的多个容器间的送液方法是使用具备一个端口的培养基供给容器、和各自具备一个被从所述培养基供给容器供给培养基的内容物移送用的端口的多个培养容器的细胞培养中的多个容器间的送液方法，将所述多个培养容器中的第一培养容器与三通阀与所述培养基供给容器利用管道连接，在所述三通阀与所述培养基供给容器之间配置1个泵，并且在所述多个培养容器中的培养容器的个数为2个的情况下，将所述三通阀与所述多个培养容器中的第二培养容器利用管道连接，在所述多个培养容器中的培养容器的个数为3个以上的情况下，在最近处连接的培养容器与三通阀之间的管道中具备新的三通阀，将该新的三通阀与下一个培养容器利用管道连接，反复进行该操作，将全部的培养容器与三通阀连接，从所述培养基供给容器经由三通阀，利用泵向所述多个培养容器中的各培养容器移送培养基。

发明效果

根据本发明，能够简化使用多个容器进行细胞培养时的容器间的流路控制。

附图说明

图1是表示本发明的第一实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的主视图。

图2是表示本发明的第一实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的俯视图。

图3是表示本发明的第二实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的主视图。

图4是表示本发明的第三实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的主视图。

具体实施方式

以下，在参照附图的同时，对本发明的细胞培养中的多个容器间的送液方法的优选的实施方式进行说明。

首先，对本发明的实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法的特征进行概述。

本发明的实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法的特征在于，是使用具备一个端口的培养基供给容器、和各自具备一个被从培养基供给容器供给培养基的内容物移送用的端口的多个培养容器的细胞培养中的多个容器间的送液方法，其中，将多个培养容器中的第一培养容器与三通阀与培养基供给容器利用管道连接，在三通阀与培养基供给容器之间配置1个泵，并且在多个培养容器中的培养容器的个数为2个的情况下，将三通阀与多个培养容器中的第二培养容器利用管道连接，在多个培养容器中的培养容器的个数为3个以上的情况下，在最近处连接的培养容器与三通阀之间的管道中具备新的三通阀，将该新的三通阀与下一个培养容器利用管道连接，反复进行该操作，将全部的培养容器与三通阀连接，从培养基供给容器经由三通阀，利用泵向多个培养容器中的各培养容器移送培养基。

另外，优选将本发明的实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法设为如下的方法，即，将多个培养容器中的各培养容器配置为在先连接的培养容器的水平位置高于在后连接的培养容器的水平位置，利用基于水平位置的落差的自然送液，进行从在先连接的培养容器向在后连接的培养容器的送液。

此外，也优选将本发明的实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法设为如下的方法，即，从在最后连接的培养容器经由三通阀利用泵向培养基供给容器移送培养液的上清液或培养液。

另外，也优选将本发明的实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法设为如下的方法，即，在培养基供给容器与泵之间的管道中具备三通阀，在培养基供给容器处分别经由三通阀利用管道连接具备一个端口的一个或两个以上的另外的培养基供给容器，从这些培养基供给容器经由三通阀利用泵向多个培养容器中的各培养容器移送培养基。

根据这样的本发明的实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法，通过在封闭体系的细胞培养系统中仅使用1台泵，就能够恰当地控制流路。

即，该方法中，将多个容器用三通阀和1个泵连接，并且将培养容器依送液的顺序设置落差地配置。

因此，就可以利用泵进行从培养基供给容器向培养容器的培养基的移送，并且能够利用基于培养容器的水平位置的落差的自然送液进行多个培养容器间的培养液的移送。另外，根据该方法，由于不需要夹管阀、夹子等，因此能够大幅度简化以往的烦杂的流路的控制机构。

(第一实施方式)

下面，参照图1及图2，对本发明的第一实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法进行说明。图1是表示本实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的主视图，图2是表示本实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的俯视图。

在本实施方式中所用的细胞培养系统中，具备2个培养容器。

即，如图1及图2所示，本实施方式中所用的细胞培养系统具备培养容器1、培养容器1a、培养基供给容器2、三通阀3、泵4、以及连接它们的管道5。

培养容器1与培养容器1a与培养基供给容器2被经由三通阀3利用管道5连接。在各容器中，具备一个用于与其他的容器进行内容物的移送的端口，在该端口处连接有管道5。

另外，在三通阀3与培养基供给容器2之间的管道5中安装有泵4。

此外，用于最先进行培养的(在先连接的)培养容器1的水平位置被配置为高于用于其后进行培养的(在后连接的)培养容器1a的水平位置。

在使用这样的细胞培养系统时，在无菌环境下向培养容器1中注入包含细胞及培养基的培养液，将培养容器1、培养容器1a、培养基供给容器2和三通阀3用管道5连接而构成封闭体系。

另外，在培养基供给容器2与三通阀3之间安装配置泵4。此外，将培养容器1的水平位置配置为高于培养容器1a的水平位置。而且，从培养基供给容器2经由三通阀3利用泵4向培养容器1移送培养基，在培养容器1中进行细胞的培养。

当培养容器1中的细胞培养结束时，继而就从培养容器1利用自然送液向培养容器1a移送培养液，从培养基供给容器2经由三通阀3，利用泵4向培养容器1a移送培养基，在培养容器1a中进行细胞的培养。

此时，优选在自然送液之前，搅拌培养容器内的培养液。另外，优选在进行自然送液时，倾斜载放有培养容器的架台，使得培养容器的端口为下。如果如此操作，则能够高效地进行培养容器间的自然送液。有关这样的自然送液的方法在以下的实施方式中也可以同样地进行。

此外，该情况下，为了将培养基加温，也可以从培养基供给容器2经由三通阀3，利用泵4先向培养容器1移送培养基，在培养容器1中培养基被充分地加温后，将培养基利用自然送液向培养容器1a移送。对于以下的实施方式的各个培养容器也可以同样地进行这样的培养基的加温。

当培养容器1a中的细胞培养结束时，即从培养容器1a经由管道5和三通阀3，利用泵4向变空了的培养基供给容器2移送培养液的上清液，可以将培养容器1a中的培养液浓缩。另外，同样地也可以从培养容器1a向培养基供给容器2移送培养液。

对于培养容器的容量及培养面积，为了能够培养像后面连接的培养容器那样多的细胞，优选像后面连接的培养容器那样增大。

培养容器1及培养容器1a优选以软包装材料为材料制成袋状(袋型)，为了可以确认内容物，优选一部分或全部具有透明性。

另外，这些培养容器需要具有细胞的培养所必需的透气性(氧气及二氧化碳透过性)，优选在37℃、5％二氧化碳浓度的培养环境下使用。此外，为了实现高的细胞增殖效率，这些培养容器优选具有低细胞毒性、低溶出性、以及辐照灭菌适应性。

作为满足这样的条件的培养容器的材料，优选聚乙烯系树脂。作为该聚乙烯系树脂，可以举出聚乙烯、乙烯与α－烯烃的共聚物、乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、使用了乙烯和丙烯酸或甲基丙烯酸共聚物和金属离子的离聚物等。另外，也可以使用聚烯烃、苯乙烯系弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、硅酮树脂等。

可以采用培养容器的四边被利用热封密封了的容器。培养容器2的收容部的形状可以设为长方形，另外也优选如图2所示，以随着朝向端口逐渐变窄的方式构成。而且，培养容器也可以是借助吹塑成形的一体成型袋。

为了不使所存放的培养基的ph在培养期间中大幅度变化，培养基供给容器2优选具有对氧气及二氧化碳的阻气性。这是因为，为了避免培养基中所含的高浓度的二氧化碳气体向空气中释出，培养基中的二氧化碳气体浓度降低，结果使得ph升高，最好尽可能减少二氧化碳从培养基供给容器2的内部向外部漏出。另外还因为，最好防止培养基的氧化。

三通阀3的种类没有特别限定，然而由于容易实现细胞培养系统中的封闭体系，因此可以合适地使用封闭式三通阀。

另外，泵4的种类也没有特别限定，然而从相同的观点考虑，可以合适地使用蠕动泵(r)等软管滚轮泵。

管道5的材料只要与使用环境匹配地适当选择即可，在co2培养箱内使用的情况下，尤其优选对于氧气及二氧化碳的透气性优异的材料。在co2培养箱外使用的情况下，优选阻气性优异的材料。例如可以使用硅橡胶、软质氯乙烯树脂、聚丁二烯树脂、乙烯－乙酸乙烯酯共聚物、氯代聚乙烯树脂、聚氨酯系热塑性弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、苯乙烯系弹性体等。另外，作为苯乙烯系弹性体，例如可以使用sbs(苯乙烯·丁二烯·苯乙烯)、sis(苯乙烯·异戊二烯·苯乙烯)、sebs(苯乙烯·乙烯·丁烯·苯乙烯)、seps(苯乙烯·乙烯·丙烯·苯乙烯)等。

特别是，在管道5中的安装泵的部分，可以合适地使用硅酮管道，在其他的部分可以合适地使用软质氯乙烯树脂管道。

本实施方式的培养细胞的种类没有特别限定，例如能够合适地培养淋巴细胞等悬浮系细胞、或皮肤细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、间叶系干细胞等贴壁系细胞。

(第二实施方式)

下面，参照图3，对本发明的第二实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法进行说明。图3是表示本实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的主视图。

在本实施方式中所用的细胞培养系统中，具备3个培养容器。

即，如图3所示，本实施方式中所用的细胞培养系统具备培养容器1、培养容器1a、培养容器1b、培养基供给容器2、三通阀3、三通阀3a、泵4、以及连接它们的管道5。

培养容器1、培养容器1a和培养基供给容器2与第一实施方式相同，被经由三通阀3利用管道5连接。另外，三通阀3与三通阀3a被利用管道5连接，培养容器1a、三通阀3a和培养容器1b被利用管道5连接。在各容器中，具备一个用于与其他的容器进行内容物的移送的端口，在该端口处连接有管道5。

另外，在三通阀3与培养基供给容器2之间的管道5中安装有泵4。

此外，用于最先进行培养的(在先连接的)培养容器1的水平位置被配置为高于用于其后进行培养的(在后连接的)培养容器1a的水平位置，培养容器1a的水平位置被配置为高于用于其后进行培养的(进一步在后连接的)培养容器1b的水平位置。

而且，本实施方式中，也可以设置4个以上的培养容器，与培养容器1a、培养容器1b相同，采用经由三通阀利用管道5与培养容器1及培养基供给容器2连接的构成。该情况下，优选与培养容器1a、培养容器1b相同，将在先连接的培养容器的水平位置配置为高于在后连接的培养容器的水平位置，能够将细胞悬浮液从在先连接的培养容器向在后连接的培养容器自然送液。

另外，也优选在最后进行培养的培养容器中，具备取样用的另外的端口，在该端口处连接取样管道。

在使用这样的细胞培养系统时，在无菌环境下向培养容器1注入包含细胞及培养基的培养液，将培养容器1、培养容器1a、培养容器1b、培养基供给容器2、三通阀3和三通阀3a用管道5连接而构成封闭体系。

另外，在培养基供给容器2与三通阀3之间安装配置泵4。此外，将培养容器1的水平位置配置为高于培养容器1a的水平位置，将培养容器1a的水平位置配置为高于培养容器1b的水平位置。而且，从培养基供给容器2经由三通阀3，利用泵4向培养容器1供给培养基，在培养容器1中进行细胞的培养。

当培养容器1中的细胞培养结束时，继而就从培养容器1向培养容器1a利用自然送液移送培养液，从培养基供给容器2经由三通阀3、3a，利用泵4向培养容器1a移送培养基，在培养容器1a中进行细胞的培养。

另外，当培养容器1a中的细胞培养结束时，继而就从培养容器1a向培养容器1b利用自然送液移送培养液，从培养基供给容器2经由三通阀3、3a，利用泵4向培养容器1b移送培养基，在培养容器1b中进行细胞的培养。

当培养容器1b中的细胞培养结束时，即从培养容器1b经由三通阀3a及三通阀3，利用泵4向变空了的培养基供给容器2移送培养液的上清液，可以将培养容器1b中的培养液浓缩。另外，同样地也可以从培养容器1b向培养基供给容器2移送培养液。

而且，本实施方式中，在设有4个以上的培养容器的情况下，也与上述相同，将培养液利用自然送液从在先连接的培养容器向在后连接的培养容器移送，在在后连接的培养容器中进行细胞的培养。而且，当在最后连接的培养容器中的细胞培养结束时，从该培养容器经由多个三通阀，利用泵4向变空了的培养基供给容器2移送培养液的上清液，可以将该培养容器中的培养液浓缩。另外，同样地也可以从该培养容器向培养基供给容器2移送培养液。

本实施方式的培养细胞的种类没有特别限定，例如可以合适地培养淋巴细胞等悬浮系细胞。

该情况下，可以将培养容器1作为用于进行用于恢复受到损害的细胞的功能的养护培养及扩大培养的容器合适地使用。即，从患者采集的细胞、或冷冻保存后被解冻了的细胞之类的受到损害而功能衰减的细胞在原样不变的状态下即使意欲使之活化也无法充分地进行，无法用于细胞的大量培养。因而，为了使这样的细胞增殖，以使细胞本来的功能恢复的方式，在细胞培养的初期的阶段中进行一边养护该细胞一边培养的培养工序(养护培养工序)。此后，在细胞本来的功能恢复、且细胞的增殖推进到一定程度后扩大培养面积，进行继续细胞的培养的培养工序(扩大培养工序)，直至达到给定的细胞密度为止。因而，该情况下，优选具备能够扩大培养面积的培养容器1，其方法没有特别限定。

另外，该情况下，优选将培养容器1a作为用于使细胞活化的培养工序(活化培养工序)中所用的活化培养容器使用。在这样的培养容器1a内的底面上，固相化有抗cd3抗体等使细胞活化的物质，收容于培养容器1a中的细胞与该物质结合而被活化。抗cd3抗体适合用于使淋巴细胞活化。

此外，该情况下，优选将培养容器1b作为用于使细胞大量增殖的培养工序(扩增培养工序)中所用的扩增培养容器使用。

另外，优选使培养容器1a的容量大于培养容器1的容量，例如可以合适地使用培养容器1的容量的2倍以上的培养容器。另外，由于培养容器1b是为了使细胞大量增殖而使用，因此优选使用容量特别大的培养容器，例如可以合适地使用培养容器1a的容量的10倍左右的培养容器。

另外，本实施方式中，也可以培养皮肤细胞、角膜细胞、血管内皮细胞、间叶系干细胞等贴壁系细胞。该情况下，例如优选设为如下的构成，即，在培养基供给容器2与泵4之间的管道5中具备三通阀，经由该三通阀，连接封入有用于将细胞从培养容器的内面剥离的酶溶液的酶溶液供给容器、和封入有用于阻碍该酶的作用的阻碍剂溶液的阻碍剂溶液供给容器。此外，也可以同样地连接清洗液供给容器、废液回收容器等另外的容器。

该情况下，对于培养容器的容量及培养面积，为了可以高效地进行继代培养等，也优选像后面连接的培养容器那样增大。

本实施方式中，对于培养容器的材料或性质、形态等，可以设为与第一实施方式相同。另外，对于培养基供给容器2的性质、三通阀3和泵4的种类、管道5的材料，也可以设为与第一实施方式相同。

(第三实施方式)

下面，参照图4，对本发明的第三实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法进行说明。图4是表示本实施方式的细胞培养中的多个容器间的送液方法中所用的容器的连接关系的主视图。

本实施方式中所用的细胞培养系统中，具备3个培养容器，且具备2个培养基供给容器。对于其他方面，可以设为与第二实施方式相同。

即，如图4所示，本实施方式中所用的细胞培养系统在第二实施方式的构成以外，还具备三通阀6和培养基供给容器2a，三通阀3与三通阀6被利用管道5连接，并且培养基供给容器2与三通阀6与培养基供给容器2a被利用管道5连接。

这些培养基供给容器的性质可以设为与第一实施方式相同。另外，在培养基供给容器2和培养基供给容器2a中，可以封入相同的培养基，也可以封入不同的培养基。

另外，本实施方式中，也可以设为如下的构成，即，设置3个以上的培养基供给容器，与培养基供给容器2a相同，经由三通阀利用管道5与培养基供给容器2及各培养容器连接。

这样的本实施方式可以特别合适地用于向多个培养容器供给不同的培养基的情况。

例如，可以从培养基供给容器2a向培养容器1和培养容器1a供给培养基，在培养容器1中进行上述的养护培养工序及扩大培养工序，在培养容器1a中进行上述的活化培养工序。另外，继而可以从培养基供给容器2向培养容器1b供给培养基，在培养容器1b中进行上述的扩增培养工序等。

以上，对于本发明，给出优选的实施方式而进行了说明，然而本发明并不限定于前述的实施方式，当然可以在本发明的范围中实施各种变更。

例如，可以在第一实施方式中，采用像第三实施方式那样具备多个培养基供给容器、或还具备其他容器的构成等，适当地进行变更。

产业上的可利用性

本发明可以适合用于使用多个培养容器在封闭体系中大量培养细胞的基因治疗、免疫疗法、再生医疗或抗体医药生产等中。

将本说明书中记载的文献及成为本申请的巴黎优先权的基础的日本申请说明书的内容全都引用到此处。

符号的说明

1、1a、1b培养容器，2、2a培养基供给容器，3、3a、3b三通阀，4泵，5管道，6三通阀。